实验六 DNA的体外连接
第五章DNA的体外重组与基因转移精品PPT课件
目的基因获得了,载体也选好了，下一步的工作就 是将目的基因连接到载体上形成一个重组DNA分子并导 入细胞。
第一节 重组DNA分子的构建
基因重组是依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶 和其他修饰酶的作用，分别对外源目的基因的片段和 表达载体DNA进行适当切割和修饰后，将外源片段和表 达载体巧妙的，再转入受体细胞，实现目的基因在受 体细胞内的。
如下图所示
（一）粘性末端连接法 1. 同一限制酶切位点连接 ③ 存在问题
这种连接方式中，不可避免地会形成载体DNA的 自连和目的DNA的自连，因此，实际操作中必须控制 自我环化现象的发生。
④ 解决方法
通过调节连接反应中外源DNA和载体DNA浓度可以限 制载体DNA自身环化；
（一）粘性末端连接法 1. 同一限制酶切位点连接 ④ 解决方法
（一）粘性末端连接法
1. 同一限制酶切位点连接 ② 举例
如：质粒载体用EcoRⅠ切割后，环状质粒就被切
成具有EcoRⅠ粘性末端的线性质粒；如果外源基因也
用EcoRⅠ切割，并混于上述粘性末端质粒溶液中反应，
则目的基因的两端就会与线性载体两端的粘性末端互
补配对，在连接酶的催化下形成共价连接的环形重组
质粒。
一、在外源目的基因与表达载体连接的重组过程中， 一般需要考虑到以下几个因素：
• 实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重组子筛选； • 重组DNA分子，应能被一定的限制性核酸内切酶重新
切割，以便回收插入的外源DNA片段； • 外源基因必须在表达载体DNA的启动子控制之下，并置
于正确的阅读框架之中，以便目的基因的高效表达；
脱离脉冲电场，被击穿的微孔即可复原。然后置于
丰富的培养基中生长数小时后,细胞增殖,质粒复制。
高中生物中图版(2023)生物技术实践第六单元蛋白质和DNA技术 第6章第2节
第二节DNA片段的扩增——PCR技术一、DNA在细胞内的复制1．所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。
2．引物：一段RNA。
3．原料：四种脱氧核苷酸。
4．原则：碱基互补配对原则。
二、PCR技术的过程1．把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到微量离心管中。
2．把离心管置于95℃的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。
3．将离心管置于55℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。
4．再将离心管转置于72℃的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。
这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。
三、实验操作1．准备(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95℃、55℃和72℃，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。
2．扩增3．检测利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。
即：DNA的浓度(μg/mL)＝错误!×稀释倍数。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至95 ℃左右，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA 单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次温度体内温和条件高温(可变)相同点①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③都需要一定的缓冲溶液④子链延伸的方向都是从5′端到3′端①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。
基因片段与载体连接、转化和重组子筛选
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养 基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提
基因克隆实验报告
实验单元6：基因克隆学号No.：姓名Name：日期Date：2014，04，26摘要：基因克隆是在体外将目的基因（或其它有意义的DNA片段）同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究。
通过PCR法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。
本实验应用RT-PCR技术从团头鲂肝脏RNA中扩增β-actin基因cDNA片段，并克隆到质粒载体pMD18-T，鉴定测序。
结果显示：只有少数组别成功克隆出目的基因片段。
关键词：基因克隆；T-A克隆；团头鲂；β-actin基因一、前言对PCR产物进行克隆是分子生物领域以及基因工程领域中常用的方法，随着PCR方法应用的多元化，PCR产物的克隆显得尤为重要。
以前对PCR产物进行克隆实验，采用的方案大概有以下几种：一是用Klenow酶或单链核酸酶（如S1核酸酶或绿豆核酸酶）将PCR产物的两端切成平末端，然后克隆到也切成平端的质粒载体上，或在PCR产物的两端加上人工接头（Linker），经过限制性内切酶处理以后，再克隆到用相应限制性内切酶酶切产生的载体上；二是在设计PCR产物时，在引物的)!端引入特异性的内切酶识别序列，在PCR反应结束后，将PCR产物用相应的限制性内切酶进行处理，使之两端产生粘性末端，以便于克隆到载体的相应酶切位点上[1]。
这两种方法都很烦琐，而且，第一种方法的克隆效率很低，第二种方法在进行酶切处理时，如果PCR产物本身含有相应的酶切位点时，则有可能切断PCR产物。
近年来发展了几种PCR产物的直接克隆方法，一种是T4 DNA 聚合酶补平，另一种是T-A克隆法。
其中，T-A克隆法不仅操作简便，而且大大提高了克隆效率，已经成为克隆PCR产物的主要方法之一。
但是，在采用T-A克隆法时，随着插入片段长度的增加，克隆效率明显下降，尤其是当PCR产物长度大于3000bp时，其克隆效率甚至会低于平末端的克隆效率。
分子生物学实验报告全解(有图有真相)
分子生物学实验报告慕蓝有志班梦想学院目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验八RT-PCR扩增目的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验十感受态细胞的制备及转化 (23)实验十一克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验十二地高辛标记的Southern杂交 (27)实验十三阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达 (31)思考题 (32)分子实验心得总结 (33)实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常用的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1. 胰蛋白胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养皿2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
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（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
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三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
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（一）引入酶切位点连接法
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电转化的原理图（引自孙明，2006）
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（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
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二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
分子克隆技术实验操作手册
生物秀实验频道——专业生物实验中心 /bio101/ 分子克隆技术 实验操作手册 2005生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。
分子克隆技术课程主要是针对生物技 术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开 设的实验课。
实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分 子克隆和分子杂交两大部分：分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。
本实验利用质粒载体 克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、 酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有 Southern blotting， Northern blotting，Western blotting 及 Dot blotting 等。
Southern blotting 是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的 DNA，经过琼脂糖凝胶 电泳按大小分离酶切所得的片段，随后 DNA 在原位发生变性并从凝胶转移到一固相 支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。
DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对 位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素)标记的 DNA 探针与固着在膜上的 DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分 析。
本实验要求掌握植物总 DNA 的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA 的琼 脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。
在转录水平上 研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。
为让学生初步 了解有关RNA的操作过程注意事项，我们还列出Northern blotting的操作步骤以供 选择。
目 录系列一 分子克隆技术 (4)实验一 质粒的制备 (4)实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 (5)实验三 外源 DNA片段在质粒载体中的克隆 (7)实验四 感受态细胞的制备 (9)CaCl2 感受态细胞的制备实验步骤 (9)电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 (10)实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 (11)热激法转化实验步骤： (11)质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 (12)实验六 PCR技术 (12)系列二 Southern 杂交技术 (14)实验一 植物总 DNA的快速少量抽提（CTAB 法） (14)实验二 总 DNA质量检测及酶切 (15)实验三 电泳、转膜 (16)实验四 Southern Blotting (18)系列三 Northern Blotting (24)实验一 RNA Extraction (mini prep) (24)实验二 RTPCR (Reverse transcription PCR) (26)实验三 RNA的电泳，转膜和杂交 (28)附录 试剂配方 (29)一 细菌培养试剂 (30)二 质粒抽提试剂 (30)三 DNA操作试剂 (31)四 RNA操作试剂 (34)Stock Solution: (34)Work Solution (35)系列一 分子克隆技术实验一 质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有 重要作用。
DNA片段的连接
实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 1. 恒温水浴锅或恒温箱 2. 微量取液器 （二）材料 “实验二” 回收的DNA片段 （三）试剂 试剂盒所带：Solution入pMD18-T Vector（约0.03pmol，质粒载体 DNA）1μL，及上个实验回收的DNA（约0.1～ 0.3pmol，插入片段）的DNA溶液（TE缓冲液或 去离子水）4μL，总体积为5μL。 2. 加入与DNA溶液等量的Solution I（其中包括连 接酶、Buffer、双蒸水）5μL。 3. 混合均匀后,3000-4000rpm 离心20-30秒；最好再 混合并离心一次。 4. 16℃下连接45分钟至1小时。 5. 放于-20℃冰箱中，用于下次实验的转化。 6. 当直接进行转化时，取上述连接反应液10μL 转 化至100-200μL的感受态细胞。
连接反应液可以直接用于转化，如发现转 化效率偏低时，反应结束后向反应液中添 加NaCl使其终浓度为500mM，然后进行转 化，可改善转化效率。 另外，当转化DNA量较大或者利用电刺激 转化时，先用乙醇沉淀法精制DNA。
载体结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性， LacZ） • 独立的复制单位 载体种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
pMD18-T Vector
T-载体
连接酶：把基因缝在一起
注意事项
回收的PCR产物、载体以及SolutionI组成的 10μL反应体系需充分混匀。 在取SolutionI时，应使之不离开冰盒，以防 酶活性的破坏。 如果反应温度升高（>26℃），较难形成环 状DNA。因此反应必须于16℃进行。 当连接反应难以进行时，可以适当延长反应 时间。当连接效率仍然无所改变时，可对 DNA进行乙醇沉淀从而浓缩后再反应。
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5 l
稀释10倍的CIAP酶
1 l （3 U）
37℃恒温箱消化30 min。
注：浓度高的酶可以用水和反应buffer进行稀释，稀释后的酶 液应在1×的buffer里；稀释的酶先用现配，用后弃去。
100 l稀释体系（1.5 ml离心管）：
灭菌ddH2O
80 l
CIAP Buffer
10 l
CIAP酶
10 l
加样顺序：水、buffer、酶 ，轻柔混匀后短暂离心收集到管底备用。
3、脱磷pSK载体的回收
在上述脱磷体系中加入ddH2O 调整体积到200 l，然后 加入等体积的BD溶液，然后利用DNA凝胶回收试剂盒从 步骤5开始进行回收，最后用30 l的Eluent进行洗脱。
4、目的片段和载体的琼脂糖凝胶电泳定量
3、目的DNA片段与载体DNA之间的摩尔浓度比例一般是3:1~1:1，并且使反形成多分子连接 的寡聚物，造成片段多拷贝插入。
思考题（DNA 的体外连接）
1、pSK单酶切后，为什么要进行去磷酸化？MP3回收片段是否也要进行脱磷， 为什么？载体双酶切后是否需要脱磷？为什么？ 2、T4 DNA连接酶与大肠杆菌DNA连接酶有何异同？
七、实验步骤
1、pSK载体的Hind III酶切 2、 Hind III酶切pSK载体的脱磷 3、脱磷pSK载体的回收 4、目的片段和载体的定量 5、目的片段和载体的连接 6、准备感受态细胞制备和大肠杆菌转化用试剂和用品
1、pSK载体的Hind III酶切
100 l反应体系（1.5 ml离心管）：
注意事项
1、克隆用的载体质粒要求较高纯度，使之能用最少的酶和较短的反应时间达 到完全的切断。使用过量的内切酶或CIP以及过长时间的反应会使载体末端缺 失，产生大量的假阳性菌落（白色但没有插入子）。
2、使用T4 DNA连接酶之前，应看清楚生产厂家所使用的活性定义单位，以 便采用合适的酶浓度反应条件，不致造成不必要的浪费。
实验五、DNA的体外连接
一、实验目的
学习DNA片段之间的体外连接方法
二、实验原理
DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。 DNA连接酶主要有：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌连接酶两种。T4 DNA 连接酶的底物可为：(1) 一条链带有缺口的双链DNA分子；(2) 两个存在互 补粘性末端的双链DNA片段；(3) 两个存在平末端的DNA片段；(4) RNA－ DNA杂合体中，具缺口的RNA和DNA分子。 T4 DNA连接酶催化DNA连接的反应分三步进行：(1) 辅助因子ATP中磷酸基 团与T4 DNA连接酶上的Leu残基的NH2结合，形成酶-AMP复合物；(2) 酶AMP复合物活化DNA链5’端的磷酸基团，形成磷酸－磷酸酯键；(3) DNA链3’ 端的羟基活化与5’端磷酸根形成磷酸二酯键，释放AMP，完成DNA链间的 连接。 用于克隆的质粒载体在用单酶切酶切成线状后，一般需用碱性磷酸酯酶 (CIP或BAP)进行去磷酸化处理，以防止载体自身环化，减少不含重组子的 菌落产生。
利用琼脂糖凝胶（1%）电泳法检测DNA浓度：分别取回收的 MP3酶切片段、酶切和脱磷的pSK质粒、已知浓度的λ DNA各1 l于点样板小孔中，再加入8 l TE和1 l的10 载样缓冲液， 混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下 部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。电泳后的目的片 段和载体条带的亮度与已知浓度的λ DNA的亮度进行比较，估 算出其浓度。
ddH2O、 pSK质粒DNA 和MP3酶切片段 混匀后先在45度热板上温育5 min使粘性末端分开，之后加入T4 DNA连接酶buffer和T4 DNA连接酶， 混匀，稍离心后放于4℃冰箱中连接到下次实验。
T4 DNA 连接酶
Weiss单位：连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位， 现在也称为ppi单位。
0.01个Weiss单位能在16℃，30min内将Hind III完全酶切的1ug DNA片段完全连接。（粘性末端）
1个Weiss单位在16℃，30min内能将Hae III完全酶切的1ug DNA片段完全连接。（平末端）
DNA分子连接
带有相同粘性末端的载体和外源DNA片段，在连接反应中外源片段和载体 DNA均可发生自身环化或几个分子串联形成寡聚物，而且正反两种连接方 向都有可能。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度，以便使正 确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5’-磷酸基团用碱 性磷酸酶去掉，最大限度的抑制质粒DNA的自身环化。带5’端磷酸的外源 DNA片段可以有效的与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开 环分子，在转入大肠杆菌受体菌后的扩增过程中，缺口可自动修复。
4、目的片段和pSK载体的连接（每组同时做2个载体自连对照）
10 l反应体系（0.5 ml离心管）： 酶切的pSK质粒DNA MP3酶切回收片段 10×T4 DNA 连接酶Buffer 稀释10倍的T4 DNA 连接酶 灭菌ddH2O
10-20 ng 10-20 ng 1 l 1 l（35 U） up to 10 l
pSK质粒DNA
500 ng（试剂盒抽提）
酶切Buffer
10 l
Hind III酶
1 l
灭菌ddH2O
up to 100 l
加样顺序：水、buffer、DNA、酶
37℃恒温箱酶切30 min。
2、 Hind III酶切pSK载体的脱磷
在上述100 l酶切体系中加入：
10×CIAP buffer
三、实验材料
上次实验课回收的MP3酶切片段，用试剂盒抽提的pSK质粒
四、仪器设备
电泳仪 微型电泳槽 恒温金属浴 冰箱
紫外透射检测仪
五、实验用具
冰盒 微量离心管 移液器 微量离心管（1.5 ml、0.5 ml） 吸管头若干
六、试剂
琼脂糖 0.5TBE电泳缓冲液 10 载样缓冲液 （loading buffer） GoldView I型核酸染色剂 （10000 ，Solarbio） DNA分子量标准（DNA marker）：Marker III（广州东盛生物科技有限公司） 已知系列浓度的λDNA (10、20、50、100 ng/ l )（ TaKaRa） 牛小肠碱性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase, CIAP, TaKaRa） T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase, TaKaRa） DNA凝胶回收试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）