实验三-细菌分离培养与培养性状观察
细菌的分离培养
细菌的分离培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
叶部病害分离
7. 真菌菌种的保存
分离到的真菌要用适当的保存方法，以保持它的生活力和原有 的性状，并避免其他杂菌和螨类的污染。
保存的菌种要注明菌种的种、菌系和保存日期。
有些生活力差的真菌，存放在-20度的低温冰箱中效果最好； 近年来受到重视的是超低温保存法，降菌种通过特殊的处 理后，放入-70－-80度的低温环境中。
一、实验目的
1. 为了证实其病原菌的特性；
2. 为了进一步研究病原菌的形态、生活史、生理和生态特性；
3.Байду номын сангаас为了获得其发酵液等
鉴于以上原因，分离和纯化真菌是必需的，是保证整个实 验能够顺利进行的前提。
二、实验原理
真菌的分离就是将所需要的真菌与其他杂菌分开，供给适 当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、 酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件， 即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只 利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯培养菌 株。
直接测定的方法有以下几种：
① 目力估测
优点：快速；缺点：精确度低。
② 直线生长
优点：能够进行多次测量，精确表明菌丝生长率；缺点：测量 的次数过多，容易造成培养菌的污染。
③ 湿重测定
优点：快，并且菌丝是未经处理而保持其原来的状态；
缺点：精确度低，只能测定一次，不能体现其延续性。
④ 干重测定
优点：比较精确；缺点：同上。
注意事项： ① 待分离组织必需是新鲜发病的。 ② 要掌握培养基的温度。 ③ 要掌握孢子悬浮液的浓度。
细菌的分离培养与培养性状观察
冷至约 ５ ０ ￣ Ｃ， 用接 种 环取 一环 培 养物 于 第 一管 内 ， 随
即用两手掌心搓转振荡 ， 由第一管取入第二管 ， 搓匀 又从第二管取出一环至第三管振荡后 ，分别倒入 ３ 个 灭 菌 空平 板 内 ， 摇 匀待 凝 固后 ， 倒 置于 ３ ７ ℃温箱 内 ‘ 培养 ， ２ ４小时后观察结果 。第一个平板菌落最多 ， 第 二个 、 第三个递减 ， 可得到单个菌落 。
约５ ０克置于密封容器内与接种的厌氧菌共 同培养。 焦 性 没食 子 酸 法是 利 用 焦 性 没食 子 酸与 碱作 用
板盖使 之 成 １ 条狭 缝 ， 并靠 近火 焰 旁 。右 手持 接种 环
克， １ ０ ％氢氧化钠或氢氧化钾 １ ０ 毫升。 常用方法有试 管培 养 法 ， 干 板 培养 法 ， 干燥器 培养 法 。 二 氧 化 碳 培 养 法 利 用 少 数 细 菌 如 牛 型 布 氏 杆
菌 ，在含 有 ５ ％～ １ ０ ％的二 氧化碳 环境 下生 长 良好 ， 常 用 的方 法 为 烛缸 法 。取 干燥 器 （ 盖 口抹 上 凡上 林 ） ， 将 接种 好 的平板 或 斜 面放 入 器 内 ，点 燃 燃烛 直 立 于 缸 的隔 板 上 ， 盖上盖子 ， 因器 内氧 气 耗 尽 蜡 烛 自灭 ，
１ ～ ２ 毫米者为小菌落 ； ２ ～ ４ 毫米者为 中等大菌落 ； ４ 毫 米或 更 大者 为大 菌 落或 巨大 菌落 。菌落外 形 有 圆形 、 不 规则 形 、 卷毛状 、 根 状 等 。隆 起 度呈 扩 散 、 台状 、 凸
起、 乳头 状 、 突脐 状 、 覆轮 状 等 。边缘 如整 齐 、 缺刻 状 、 圆锯齿 形 、 波 状 裂 片状 、 镀 边 等 。观察 菌 落 表 面是 否 光滑 、 皱褶 、 颗 粒状 、 同心环 状 、 龟 裂状 等 。表 面光 泽
微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
微生物检验学之细菌的培养与分离技术
细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L型的检查一、基本条件（一）细菌实验室中华人民共和国卫士行业标准中的微生物和生物医学实验室生物安全通过准则。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面1m处，每天开始工作前照射20min。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等，应安装冲眼器。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
7.细菌室必须安装生物安全柜，工作人员应在柜内处理标本及病原微生物。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
实验三 病原菌的分离培养
注：试管加棉塞(最好)
培养基分装完毕以后，在管口
上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。
加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。
（五）病原真菌的分离培养
1．组织分离法 按照以下步骤进行：
(1) 取灭菌培养皿一个，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料 和分离人的姓名。 提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将 所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌； 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要 用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸 要轻，不要说话。 (2) 取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个 病斑，用解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(边长3--4mm)病 组织数块。 提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌 混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋 生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
4. 在空试管内倒入2～3mL已经溶解好的培养基，
【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶
塞. 5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌. 6.摆斜面,凝固后放冰箱备用.
用于活化菌种， 或培养菌种的斜面
用于保存菌种的斜面
搁置斜面
当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一
端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的 斜面的长度不超过试管总长的一半。
（二）灭菌与消毒
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培 养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。 常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压 蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐源自射灭菌、化学药品灭菌等方法。
细菌的分离与培养
细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
课时安排：2课时操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
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菌落
菌苔
菌落与菌苔
一（、目三的）要细求菌在培养基上的生长表现
2、细菌在液体培养基中的生长现象
• 混浊 • 沉淀：多见于链状排列的细菌。 • 菌膜：多见于厌氧菌。
菌膜 菌沉淀
对照 均匀浑浊
一（、目三的）要细求菌在培养基上的生长表现
3、细菌在半固体培养基中的生长现象
接种环境
VS-1300-U型洁净工作台
接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 沾取标本 接种 灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
一（、一目的）要常求用的细菌培养方法
1、需氧菌分离培养法
（1）平板划线分离法
目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得 纯菌。
• 有鞭毛细菌： – 在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘 模糊。
• 无鞭毛细菌： – 只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。
无动力 现象
Hale Waihona Puke 有动力 现象思 考？
1、细菌分离培养的目的是什么？何谓纯培养？ 2、培养皿培养时为什么要倒置？ 3、描述接种细菌在液体培养基、固体培养基中
的生长表现。
纯培养物
移植培养
。。。。。。
一、目的要求
1、掌握细菌（需氧菌、厌氧菌）分离培养的基本要领 2、掌握钓菌、纯培养及移植技术 3、了解细菌在固体、液体培养基中的生长表现 4、了解培养性状对细菌鉴别的重要意义
接种工具
接种针和接种环：由三部分组组成，即环（针）、金 属柄和绝缘柄。接种前后都要过火灭菌。接种针用于 穿刺接种细菌，接种环用于固体、液体培养基的细菌 接种。
一一、、目的常要用求的细菌培养方法
1、需氧菌分离培养法
（1） 平板划线分离法
方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本。 连续划线法：适用于含菌量较少的标本。
一1、、目常的用要的求 细菌培养方法
（1）需氧菌分离培养法
1. 平板划线分离法
方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本。
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
实验三 细菌分离培养与培养性状观察
一、目的要求 从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法成为分离；
纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由 一个细菌分裂、繁殖而产生的后代；
分离培养的目的在于从被检材料中、或者从污染的众 多杂菌中分离出纯的病原菌。
一、目的要求被检材料或病料
分离
单个菌落
纯培养
二、材料
1. 器材：接种环、酒精灯、打火机。 2. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基及其培
养液，试管斜面培养基。 3. 菌种：未知混合菌种。
一（、目三的）要细求菌在培养基上的生长表现
1、细菌在固体培养基中的生长现象
• 菌落 – 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单 一肉眼可见的细菌集团。 – 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、 湿润度、黏度、溶血性。
连续划线法
一（、一目的）要常求用的细菌培养方法
2、厌氧菌分离培养法
（1）肝片肉汤培养法 （2）焦性没食子酸法
一（、一目的）要常求用的细菌培养方法
3、兼性厌氧菌分离培养法
一（、目二的）要钓求菌、纯培养及细菌移植技术
细菌移植
斜面培养基接种法：用于培养，保存菌种及其它实验用。
液体培养基接种法：用于增菌及鉴定细菌生长特点，如表面 生长，沉淀生长，均匀混浊生长等。