悬浮细胞的传代培养
叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
6叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
答：（一）悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：
1、直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶（皿）
2、离心传代法：①将细胞悬液转移到离心管内；②800～1000r/min离心5min，弃上清；③加新的培养液到离心管内；④吸管吹打成为细胞悬液；⑤分瓶（皿）培养。
（二）半贴壁细胞和贴壁细胞的传代：采用消化法。
消化液是：0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA、二者混合液、最好在37℃或室温（25℃以上）环境进行。
其操作步骤（以25ml培养瓶为例）: （1）弃去旧培养液；（2）漂洗：加入2mll 无Ca2+、Mg2+的PBS，漂洗1次后倒掉；（3）消化：加入消化液，使之铺满细胞表面（待肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，残液继续作用2~3min，轻轻摇动，细胞层可随残液呈片状脱落下来，显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时立即终止消化）；（4）吹打：加入完全培养基5mll，用吸管按顺序进行反复吹打瓶壁，吹打时不要用力过大。
（5）调整至合适细胞浓度，分瓶培养。
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
首先，在细胞生长形态上，贴壁细胞通常呈现典型的单层或多层附着
细胞的形态，细胞扩张生长速度较慢，细胞形态变化较小。
而悬浮细胞则
以单个细胞或细胞集合体的形式存在于液体培养基中，生长速度较快，细
胞形态较为多样化。
其次，在培养条件上，贴壁细胞需要在培养基中添加黏附分子或包袋
来增加其附着能力，以保持细胞在培养皿底部的黏附和生长。
而悬浮细胞
则需要在培养基中添加抗聚集剂或搅拌设备来避免细胞结块，以保持细胞
的均匀悬浮和生长。
再次，在传代方法上，贴壁细胞传代通常采用单层脱离法或酶消化法。
单层脱离法利用细胞与培养皿表面的非共价键结合进行脱离，可通过物理
刮擦或液体冲击等方法将细胞从培养皿上收集下来。
酶消化法则通过加入
蛋白酶等酶类物质分解黏附细胞与基质之间的胶原纤维等结构，使细胞能
够从培养皿表面脱离。
而悬浮细胞传代则更为简单，通常只需要将培养基
中的细胞离心沉淀后，将上清液中的细胞重新悬浮于新的培养基中即可。
此外，在培养基的选择上，贴壁细胞通常需要使用固体培养基，例如
含有胶原蛋白、明胶或滤纸等的培养基。
而悬浮细胞则需要使用液体培养基，例如含有血清或植物基因表达培养基等。
最后，在细胞应用方面，贴壁细胞通常用于细胞粘附、增殖和分化等
研究领域，如肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。
而悬浮细胞则常用于
细胞悬浮培养、蛋白质表达和病毒培养等研究领域，如白细胞、骨髓细胞
和病毒感染细胞等。
细胞大规模悬浮培养流程简介
•.
4•
细胞复苏注意事项
· 注意全程无菌操作 · 溶解冻存细胞时速度一定要快 ，避免缓慢升温细胞内形成冰
晶 ，对细胞造成损伤 · 计算合适的接种密度 ，一般CHO细胞培养的接种密度范围在
3.0-6.0*10E5个/ml · 注意安全：取出冻存管时防止冻伤 ， 同时注意有无液氮渗透
细胞株 摇瓶 WAVE或者种子罐
收货细胞液
反应器培养
•.
1 细胞复苏
· 将水浴管 ，用镊子夹住迅速放入水浴锅中晃动， 直至完全溶解后将冻存管表面消毒转移至超净工作台内进行 操作
· 将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入约10ml培养液，轻 轻吹打混匀
· 将细胞悬液经800-1000rpm离心5分钟，弃去上清液
CHO细胞培养流程简介
•.
一 悬浮培养特点 （suspension culture)
· 非贴壁依赖型细胞的一种培养方式 · 细胞悬浮于培养基中生长或者维持 · 某些贴壁依赖型细胞经过适应和选择后也可
用此方法培养 · 使用振荡或者转动装置使细胞始终处于悬浮
状态
•.
二 CHO细胞大规模悬浮培养工艺流 程
液打入反应器进行扩培 · 当反应器内细胞密度达到要求后 ，接种至下一级反应器开始
生产阶段培养
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4 反应器生产阶段培养
· 取样 · 补碱 · 补料 · 补糖 · 收获
•.
取样
· 取样瓶灭菌 · 将取样瓶连接至反应器取样口 ，开始管路灭菌 · 灭菌完成后等待管路冷却 · 开始取样 · 取样完成后用纯蒸汽冲洗取样管路 · 将所取细胞液测定细胞密度、活力、pH值等参数
细胞传代培养实验
实验步骤
注意事项
1. 吹打制悬：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2. 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10 ml 离心管中。 3. 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1 000 转/分钟离心 5 分钟。 4. 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2 ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬 液。 四、分装稀释细胞 1. 分装：将细胞悬液吸出分装至 2~3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的 5 生长，传代细胞的密度应该不低于 5×10 /ml，最后要做好标记。 五、传代培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附 在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25%时为一个+，占 50%为++，占 75%时为+++。
（细胞培养技 术）实验方法 原理
培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。 贴壁生长的细胞用消化法传代； 部分贴壁生长的细胞 用直接吹打可传代； 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代， 或用自然沉降法吸除上 清后，再吹打传代。
实验材料
细胞
试剂、试剂盒
D-Hanks 液小牛血清 RPMI1640 双抗胰蛋白酶 EDTANHClNaHCO3
收起
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
注意事项
1. 严格的无菌操作 2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消 化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立 即终止消化。 附：0.25% 胰酶（胰蛋白酶，Trypsin） 配方：100 ml PBS，0.25 g 胰酶。 步骤：先配 100 ml PBS。 称胰酶 0.25 g。加入 PBS 中，低速搅拌。调 pH7.4。过滤，分装，-20℃ 保存，4℃短期内用完。 注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活；对难 消化的细胞，在上述配方中，加入 0.02 g 的 EDTA（0.02%） 根据细胞生长的恃点，传代方法有 3 种：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代（Hela 细胞） 、贴壁生长细胞传代。
悬浮细胞培养流程
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悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。
进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。
从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3.首先观察培养板孔中培养液量。
用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。
再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。
吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
原代和传代细胞的培养和维持
原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。
传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。
应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。
悬浮细胞培养技术讲义
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。
进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。
从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3.首先观察培养板孔中培养液量。
用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。
再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。
吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
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悬浮细胞的传代培养
关键词：细胞菌株标准物质中心北京标准物网
1)训练目的
熟练掌握悬浮细胞的传代培养法。
2）买验原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，维持细胞种的延续。
放平细胞瓶，当发现悬浮细胞长到瓶壁85％～90％时，从容器中取出细胞，以1：2或1：3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为悬浮细胞的传代培养。
3)实验材料
CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75％酒精棉球、酒精灯、悬浮细胞株、完全培养基(RPMLl640或DMEM)。
4)操作步骤
A.热培养用液：把已经配制好的培养液瓶子放人37℃水浴锅内预热。
B.用75％酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
C.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
D.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
E.超净工作台内拆除已消毒空培养瓶的外包装。
F.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后放人超净工作台内。
G.从培养箱内取出悬浮细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用75％酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
H.静置：超净工作台内将需传代的培养瓶直立静置半小时左右，待大部分细胞都沉降到细胞瓶底，轻轻吸出1／2～2／3的旧培养基。
I.分瓶：加入新鲜培养液，按1：2或1：3的比例分装到2或3个培养瓶中，再逐瓶加入新鲜培养基。
若想节约时间，并且离心对细胞影响也不大，可采用离心的方式取代静止分离。
将培养瓶中的悬浮细胞从培养箱中取出，超净工作台内将所有含细胞的培养液转入离心管，1000r／min。
离心5 min，弃上清。
加入定量新鲜培养基重悬后以1：2或1：3的比例分装到2或3个培养瓶中培养。
如果实验需要，可以在分瓶前计数，细胞的浓度一般不低于5x105个／mL。
做好标记。