细胞悬浮培养
细胞大规模悬浮培养流程简介
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4•
细胞复苏注意事项
· 注意全程无菌操作 · 溶解冻存细胞时速度一定要快 ，避免缓慢升温细胞内形成冰
晶 ，对细胞造成损伤 · 计算合适的接种密度 ，一般CHO细胞培养的接种密度范围在
3.0-6.0*10E5个/ml · 注意安全：取出冻存管时防止冻伤 ， 同时注意有无液氮渗透
细胞株 摇瓶 WAVE或者种子罐
收货细胞液
反应器培养
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1 细胞复苏
· 将水浴管 ，用镊子夹住迅速放入水浴锅中晃动， 直至完全溶解后将冻存管表面消毒转移至超净工作台内进行 操作
· 将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入约10ml培养液，轻 轻吹打混匀
· 将细胞悬液经800-1000rpm离心5分钟，弃去上清液
CHO细胞培养流程简介
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一 悬浮培养特点 （suspension culture)
· 非贴壁依赖型细胞的一种培养方式 · 细胞悬浮于培养基中生长或者维持 · 某些贴壁依赖型细胞经过适应和选择后也可
用此方法培养 · 使用振荡或者转动装置使细胞始终处于悬浮
状态
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二 CHO细胞大规模悬浮培养工艺流 程
液打入反应器进行扩培 · 当反应器内细胞密度达到要求后 ，接种至下一级反应器开始
生产阶段培养
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4 反应器生产阶段培养
· 取样 · 补碱 · 补料 · 补糖 · 收获
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取样
· 取样瓶灭菌 · 将取样瓶连接至反应器取样口 ，开始管路灭菌 · 灭菌完成后等待管路冷却 · 开始取样 · 取样完成后用纯蒸汽冲洗取样管路 · 将所取细胞液测定细胞密度、活力、pH值等参数
第八讲植物细胞悬浮培养技术
第八讲：植物细胞悬浮培养技术摘要悬浮培养技术是一种在液态培养基中培育植物细胞的方法。
这种技术可以用于研究植物细胞的生理、生化、遗传和分子生物学。
本文将介绍悬浮培养技术的原理、方法和应用，并讨论其优缺点。
原理悬浮培养技术是将植物细胞悬浮在液态培养基中，并提供足够的营养和适宜的环境条件，促进细胞生长和分裂。
悬浮培养技术可以通过两种方法进行：自然悬浮和机械悬浮。
自然悬浮是指通过培养基中的液体流动和植物细胞的重力作用来保持细胞悬浮状态。
机械悬浮是指通过磁力搅拌或气泡强制产生的涡流来保持悬浮状态。
方法悬浮培养技术的方法主要包括以下步骤：1.选取适当的植物细胞：悬浮培养技术可以应用于多种植物细胞，例如培养基的类型和成分、植物物种、生长条件等，都会影响细胞的生长和分裂。
2.培养基制备：准备含有足够营养物质和适合生长的植物细胞的培养基。
3.细胞分离：使用细胞壁水解酶、酸碱处理或机械方法去除细胞壁，分离单个细胞。
4.细胞培养：将分离的细胞置于液态培养基中，将培养瓶放置拟南芥上，以恒定光照、温度、湿度和通风条件下日夜持续观察培养。
5.细胞传代：留置旺孔1cm左右的细胞，废弃周边细胞，再次培养。
应用悬浮培养技术可以应用于以下方面：1.生物医学研究：通过悬浮培养技术培养人类细胞，可用于药物筛选、治疗性细胞移植和组织工程学等研究。
2.分子生物学研究：由于悬浮培养技术能够大量培养植物细胞，因此可以用于高通量分析、基因克隆和表达、蛋白质组学和代谢组学研究等。
3.植物细胞与组织培养：悬浮培养技术可以用于植物组织和细胞的体外培养，利用悬浮培养技术可以大量制备植物生长激素和次生代谢产物。
优缺点悬浮培养技术有以下优点：1.可以大规模培养细胞。
2.可以简化分离和培养过程，使得实验成本低廉。
3.可以控制培养环境，减少外界干扰。
悬浮培养技术也存在以下缺点：1.悬浮培养技术对培养条件和营养要求非常苛刻，因此需要经验丰富的实验人员进行操作。
2.悬浮培养技术可能会产生细胞堆积的问题，从而影响细胞生长和分裂。
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
悬浮培养流程
悬浮培养流程
答案：
1.将准备好的冻存细胞放入37℃水浴中解冻。
2.用70%乙醇对顶端进行消毒，用吸管将细胞转移到含有5miwan全MEM-10培养基的25cm2组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，放入5%C02加湿培养箱中37℃培养过夜。
3.将培养基吸出，用0.5ml37°℃的胰酶/EDTA覆盖细胞，消化30~40s。
4.加入10ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞转移至50ml的离心管中。
室温1800g离心5min，弃上清。
5将细胞沉淀悬浮在5ml的旋转瓶wan全培养基-5中，上下吹打，将细胞团打散。
6.在100ml或200ml通气旋转瓶中加入50ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞悬液转移到瓶中。
7.取出1ml细胞悬液，用血细胞计数器进行细胞计数。
加入适量的旋转瓶wan全培养基-5，使细胞密度为(3~4)x105细胞/m1。
将细胞放入无CO2培养箱，37℃旋转培养，
8.随后的两天让细胞继续生长，并且每天对细胞进行计数，加入适量的旋转瓶wan全培养基-5以维持(3~4)x105细胞/ml的细胞密度
9.取1ml的细胞县液，用血细胞计教器对细胞进行监测。
10.当细胞密度达到(4~5)x105细胞/ml时，隔天或每天用培养基将细胞稀释至1.5x105或2.5x105细胞/ml。
11.分别将装有50ml或100ml细胞县液的100ml或200ml通气旋转瓶放入37℃C无CO2培养箱旋转培养。
每天或隔天传代。
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法：
1. 准备悬浮细胞：首先需要收集悬浮细胞，如白血球、淋巴细胞、骨髓细胞等。
通常，可以采用离心法或者血液透析法来收集悬浮细胞。
2. 培养基准备：根据细胞的种类和需要，选择合适的培养基，加入适量的生长因子、荷尔蒙和营养物质等。
调节培养基的pH值和渗透压等因素，以适应悬浮细胞的生长环境。
3. 培养悬浮细胞：将收集到的悬浮细胞放入已经准备好的培养基中，放入培养箱中进行培养。
注意控制培养箱中的温度、湿度、氧气浓度等因素。
定期更换培养基。
注意事项：
1. 避免过度离心：在离心悬浮细胞的过程中，一定要注意不要离心得太久或太快，以免对悬浮细胞造成不必要的损伤。
2. 控制培养条件：悬浮细胞比较敏感，生长条件的变化会对细胞生长产生影响。
因此，需要掌握培养箱中温度、湿度、氧气浓度等参数，避免不必要的波动。
3. 定期更换培养基：悬浮细胞在培养基中的生长、分裂、代谢需要大量的营养物质和生长因子等，因此需要定期更换培养基，以保持培养基的新鲜度、悬浮细胞的生长状态。
4. 避免感染：元培养含有丰富的营养物质，容易滋生细菌或真菌等，因此需要采取严格的无菌操作，以避免培养基的污染。
第三章 植物细胞的悬浮培养
二. 操作程序
（八）悬浮细胞的活力和生长速度 悬浮细胞的活力和生长速度受到悬浮培养起始密度的 影响，如果培养时间过长（5～7天或更长）、细胞积 累量多时，培养基的成分和pH值均发生较大的改变， 往往造成细胞活力下降，细胞生长减慢。一般继代培 养（更换新鲜培养基）3天时的细胞活力最强，常常用 此时的细胞为材料进行原生质体游离和培养及诱变处 理等。
实例
白木香
二. 操作程序
（十）悬浮细胞的分散度、生长速度与植株再生能力之间的关 系 一般来讲，如果一个悬浮细胞系分散程度越高，生长速度越快， 在一定时间内，细胞分裂的代数也就越多，也就越易产生突变， 其分化能力也就越容易丧失，因此，悬浮细胞在继代培养过程 中，每隔一段时间（1～2个月）就应检查一下它的分化能力。 自诱导愈伤组织到建立一个良好的悬浮细胞系大约需要4～6个 月或更长的时间，因此尽量保持其分化能力极为重要。 保持其分化能力的方法有二个：超低温保存是一个极有效的方 法，经过超低温保存的悬浮细胞，不会影响其各种性质，同对 照组相同。 固体培养基上保持悬浮细胞的分化能力。
二伤组织的形成和植株再生 悬浮细胞的分裂、分化通常有两个途径，一个是直接形成体细 胞胚；另一个是先形成肉眼可见的愈伤组织，通过愈伤组织进 一步再生植株。 某些有机附加物如水解酪蛋白、酵母提取物、谷氨酰胺等对悬 浮细胞再生植株均是有益的。另外高渗（如提高蔗糖含量）、 活性炭对体细胞胚的形成也有良好的效果。 对于单细胞、或较小的细胞团、或低密度的悬浮细胞不适于直 接在简单的固体培养基上再生愈伤组织，可先在液体培养基中 静置培养使细胞分裂，形成较大的愈伤组织，看护培养对提高 植板率可能是最有效的方法之一。
杨柏云
南昌大学生命科学学院
植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选
第八章植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选第一节植物细胞悬浮培养体系的建立和愈伤组织诱导与植株再生一、植物细胞悬浮培养的定义植物细胞悬浮培养（Plant cell suspension culture），是指将植物细胞或小的细胞团（包括含少数细胞的小的分生细胞团或细胞聚集体）放在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。
这些细胞或小的细胞团来自愈伤组织，或某个器官或组织，通过物理或化学的方法进行分离而获得。
二、建立一个良好细胞悬浮培养体系应具备的条件建立一个成功的细胞悬浮培养体系（简称悬浮细胞系）必须满足三个基本条件：①细胞或小的细胞团在液体中分散性良好，小细胞团在几十个细胞以下。
很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系。
②均一性好，即细胞形状、大小及细胞团大小均匀一致。
在倒置显微镜下观察，悬浮细胞系内的细胞团体积和形状比较一致。
③液体培养基中细胞分裂旺盛，细胞生长迅速，一般2〜3天生长量可增加一倍。
植物悬浮细胞系不仅为原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础，同时也为遗传转化提供良好受体，还可以用来生产植物次生代谢产物。
因此，植物细胞悬浮培养是植物细胞工程技术中很有价值的技术手段。
三、建立良好悬浮细胞系的技术关键影响建立良好悬浮细胞系的主要因素，见图6.1。
图6.1影响建立良好悬浮细胞系的主要因素1.选择合适的基因型和外植体（1）基因型基因型是影响植物细胞悬浮培养成功的重要因素。
有的基因型容易诱导形成愈伤组织，用其为外植体进行细胞悬浮培养，细胞可以进行分裂，并可持续分裂，进一步同步化后，获得悬浮培养细胞系。
但有的基因型则与之相反。
因此，要重视起始材料基因型的筛选。
（2）外植体选择合适的外植体是细胞悬浮培养成功的另一重要因素。
外植体的选择对以后愈伤组织的诱导十分重要，是愈伤组织诱导的重要条件。
合适的外植体诱导产生疏松易碎愈伤组织，对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。
双子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶和叶片等；单子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、幼穗和花药等。
悬浮细胞培养
1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
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继代
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② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
10
③最佳继代时期：
第五章 悬浮细胞培养
1
主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
2
悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
③ FDA法
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①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
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FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7
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物理方法 化学方法
cell suspension culture 物理方法
体积选择法 通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行 分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中，从 而可能保持相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。这种方 法的优点是操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，因而不 会有其它处理所带来的对细胞活力的影响 。 低温处理法 冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程 度。收集细胞，在4摄氏度温度下处理数天，添加 新鲜培养液。
cell suspension culture
细胞初始培养
根据培养基在容器中的运动方式来区分，有4中振荡 培养方法： 旋转培养：培养瓶呈360º的缓慢旋转移动，使细胞培 旋转培养 养物保持均匀分布和保证空气供应。 往返振荡培养：机器带动培养瓶在一直线方向往返振 往返振荡培养 荡。 旋转振荡培养：机器带动培养瓶在平行面上作旋转振 旋转振荡培养 动。 搅动培养：利用搅拌棒不断转动，使培养基被搅动。 搅动培养
cell suspension culture 化学方法
饥饿法
饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。在一个培养体系中， 如果细胞生长的基本成分丧失，而导致细胞因饥饿而分裂受 阻，从而停留在某一分裂时期。当在培养基中加入所缺乏的 成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分 裂又可以重新恢复。饥饿导致的细胞分裂受阻，常常使细胞 不能合成DNA，即不能进入S期；或细胞分裂不能进行，即不 能进入M期。
连续培养是通过控制加入定量的营养物质使细胞 连续培养 生长率和细胞密度保持不变的一种培养方式，主要 用于研究和生产次生代谢物质 。 连续培养主要用 于大规模细胞培 养，通过添加新 鲜培养液和排放 已利用的培养液 来平衡营养水平， 使培养细胞长期 处于静止期状态。
cell suspension culture 开放式和封闭式区别
培养初期悬浮细胞处于 滞后期，细胞很少分裂； 进入对数生长期后，细 胞分裂活跃数目迅速增 加；经过3~4个细胞世 代之后，培养基中某些 营养物质已经耗尽，或 是有毒代谢产物的积累， 增长逐渐缓慢，进入静 止期后，增长完全停 止。
细胞数 静止期 减慢期 滞后期
对数生长期
cell suspension culture
生工学院09级 班 生工学院 级2班 李丽华
悬浮培养基
cell suspension culture
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细胞悬浮培养的定义 单细胞制备的方法
• 悬浮培养的条件 件
• 细胞初始培养
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细胞悬浮培养的类型
• 悬浮培养细胞的同步化
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国内悬浮培养技术产业化存在的挑战和展望
cell suspension culture
cell suspension culture
展望
应该认识到，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的 应用只是搭建了一个升级的工艺平台，而不是最终目的， 行业和企业发展真正的动力是新药、新疫苗、新工艺以 及配套技术的创新。例如： 无血清培养病毒生产技术的 开发，包括无血清培养基的开发；利用合适的培养基和 转染或驯化技术实现贴壁细胞的悬浮培养构建；新宿主 细胞表达品种开发，如同一种产品采用新的宿主细胞表 达或是开发一种高效表达的宿主细胞适应几种产品的表 达；利用基因工程技术，开发更安全的疫苗品种；以及 生物制品相关的关键技术和产品国产化，如个性化细胞 培养基、生物反应器、微载体、纯化装置、佐剂等。
定义1 定义 ：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞
团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细 胞工程（二级学科）
定义2 定义 ：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细
胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在 微运载体上的培养也是一种悬浮培养。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方 法与技术（二级学科）
开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培 养细胞随同培养液一起流出。 封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收 集后，又放入原培养基，所以其培养细 胞数目不断增加。
cell suspension culture 悬浮培养细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 细胞同步化 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期 。
cell suspension culture 细胞悬浮培养的类型: 细胞悬浮培养的类型
分批培养（ 分批培养（batch culture） ） 连续培养(continuous culture) 连续培养
cell suspension culture
分批培养是指细胞在一定容积的培养中进行培 分批培养 养，目的是建立单细胞培养物。
cell suspension culture 单细胞制备的方法 ：只有薄壁组 注意
机械法 酶解法 愈伤组织诱导法
织排列松散，细胞 间接触点很少时用 机械法分离叶肉细 胞才能取得成功。
cell suspension culture 悬浮培养的条件
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基 本条件： 一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小； 二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同； 三是生长迅速。
国内悬浮培养技术产业化的挑战
国际上反应器悬浮培养技术已广泛用于生物制药 生产，且在高表达细胞株的构建、个性化培养基的研 发等方面不断发展。大量新建反应器和产物表达量的 提高已导致反应器容量过剩，发达国家市场出现饱和、 向发展中国家扩展的趋势。各大生物制药巨头开始通 过合作或购并等方式进入新兴的中国市场。制药巨头 赛诺菲-安万特看中中国兼具研发和新兴市场这两种特 质，在药品研发、生产、包括动物疫苗生产等领域在 中国进行了大量投资；而诺华公司则在2009年底，通 过收购中国第二大甲流疫苗供应商—浙江天元生物股 权，快速进军中国疫苗行业。
抑制法
通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期----G1期的同步化细胞。
cell suspension culture 国内悬浮培养技术产业化存在的 挑战和展望
1、 国内悬浮培养技术产业化的挑战 2、展望 展望
ห้องสมุดไป่ตู้
cell suspension culture