3贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同
叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
6叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
答：（一）悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：
1、直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶（皿）
2、离心传代法：①将细胞悬液转移到离心管内；②800～1000r/min离心5min，弃上清；③加新的培养液到离心管内；④吸管吹打成为细胞悬液；⑤分瓶（皿）培养。
（二）半贴壁细胞和贴壁细胞的传代：采用消化法。
消化液是：0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA、二者混合液、最好在37℃或室温（25℃以上）环境进行。
其操作步骤（以25ml培养瓶为例）: （1）弃去旧培养液；（2）漂洗：加入2mll 无Ca2+、Mg2+的PBS，漂洗1次后倒掉；（3）消化：加入消化液，使之铺满细胞表面（待肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，残液继续作用2~3min，轻轻摇动，细胞层可随残液呈片状脱落下来，显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时立即终止消化）；（4）吹打：加入完全培养基5mll，用吸管按顺序进行反复吹打瓶壁，吹打时不要用力过大。
（5）调整至合适细胞浓度，分瓶培养。
贴壁细胞和悬浮细胞
聚苯乙烯结构式
每个单位生产的培养瓶的处理方法均 不同，左图为Coning公司的处理方 法。
贴壁细胞在体外培养为什么要贴壁？
重力作用
自然属性
细胞下沉
贴
至瓶底
壁
过
程
分泌细胞外基质 和粘附分子
主要原因
贴壁
细胞外基质和粘附分子
• 英文名： extracellular matrix& cell adhesion molecules, ECM&CAM • 定义：细胞粘附分子是众多介导细胞间 或细胞与细胞外间相互接触和结合分子 的统称； 细胞外基质：是由动物细胞合成并分泌到 胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。
• 接触抑制的原理：细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白,也叫做糖被,它在 细胞上起识别作用. 当细胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的时候,糖蛋白 识别了这种信息,就会使细胞停止继续繁殖。
贴壁细胞的单层生长
• 一般认为接触抑制是细胞间的一种识别作用，对多细胞动物的形态形成与稳定 具有重要性的作用。关于细胞的增殖，也有接触抑制的问题，进行单层培养的 细胞，在培养器的底部形成一层后，在它的上面就会看到增殖停止，而不会形 成多层。
二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的 亲水性——因此能不能贴壁不仅仅关乎细 胞是否有这种能力，也与有无合适的底物 （培养瓶）相关。
培养瓶的材质
• 最早的细胞培养器皿是由玻璃制作的，由于玻璃的表面是亲水的，不经过特殊 的处理，普通的细胞就可以贴附生长。 思考：玻璃的培养瓶有哪些缺点？
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
首先，在细胞生长形态上，贴壁细胞通常呈现典型的单层或多层附着
细胞的形态，细胞扩张生长速度较慢，细胞形态变化较小。
而悬浮细胞则
以单个细胞或细胞集合体的形式存在于液体培养基中，生长速度较快，细
胞形态较为多样化。
其次，在培养条件上，贴壁细胞需要在培养基中添加黏附分子或包袋
来增加其附着能力，以保持细胞在培养皿底部的黏附和生长。
而悬浮细胞
则需要在培养基中添加抗聚集剂或搅拌设备来避免细胞结块，以保持细胞
的均匀悬浮和生长。
再次，在传代方法上，贴壁细胞传代通常采用单层脱离法或酶消化法。
单层脱离法利用细胞与培养皿表面的非共价键结合进行脱离，可通过物理
刮擦或液体冲击等方法将细胞从培养皿上收集下来。
酶消化法则通过加入
蛋白酶等酶类物质分解黏附细胞与基质之间的胶原纤维等结构，使细胞能
够从培养皿表面脱离。
而悬浮细胞传代则更为简单，通常只需要将培养基
中的细胞离心沉淀后，将上清液中的细胞重新悬浮于新的培养基中即可。
此外，在培养基的选择上，贴壁细胞通常需要使用固体培养基，例如
含有胶原蛋白、明胶或滤纸等的培养基。
而悬浮细胞则需要使用液体培养基，例如含有血清或植物基因表达培养基等。
最后，在细胞应用方面，贴壁细胞通常用于细胞粘附、增殖和分化等
研究领域，如肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。
而悬浮细胞则常用于
细胞悬浮培养、蛋白质表达和病毒培养等研究领域，如白细胞、骨髓细胞
和病毒感染细胞等。
细胞传代培养实验
实验步骤
注意事项
1. 吹打制悬：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2. 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10 ml 离心管中。 3. 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1 000 转/分钟离心 5 分钟。 4. 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2 ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬 液。 四、分装稀释细胞 1. 分装：将细胞悬液吸出分装至 2~3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的 5 生长，传代细胞的密度应该不低于 5×10 /ml，最后要做好标记。 五、传代培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附 在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25%时为一个+，占 50%为++，占 75%时为+++。
（细胞培养技 术）实验方法 原理
培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。 贴壁生长的细胞用消化法传代； 部分贴壁生长的细胞 用直接吹打可传代； 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代， 或用自然沉降法吸除上 清后，再吹打传代。
实验材料
细胞
试剂、试剂盒
D-Hanks 液小牛血清 RPMI1640 双抗胰蛋白酶 EDTANHClNaHCO3
收起
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
注意事项
1. 严格的无菌操作 2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消 化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立 即终止消化。 附：0.25% 胰酶（胰蛋白酶，Trypsin） 配方：100 ml PBS，0.25 g 胰酶。 步骤：先配 100 ml PBS。 称胰酶 0.25 g。加入 PBS 中，低速搅拌。调 pH7.4。过滤，分装，-20℃ 保存，4℃短期内用完。 注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活；对难 消化的细胞，在上述配方中，加入 0.02 g 的 EDTA（0.02%） 根据细胞生长的恃点，传代方法有 3 种：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代（Hela 细胞） 、贴壁生长细胞传代。
贴壁培养与悬浮培养的区别
6 生长过程
潜伏期：悬浮,胞质回缩, 全部细胞 变为圆球形。贴附底物。有运动活 动,基本无增殖, 少见分裂相。 指数增长期：是细胞增生最活跃、 活力最旺盛的阶段培养物中细胞数 量呈指数增长,细胞群体均一。 停滞期：细胞数量达饱和密度后， 细胞遂停止增殖，进入停滞期。
7 传代培养
贴壁细胞 酶消化法传代：弃去培养液，加胰酶消化，加培 养液终止胰酶作用，离心，去上清，吹打成悬液， 分装传代。 悬浮细胞 离心法传代：离心，弃上清液，加新鲜培养基， 分装传代。 直接传代法：待细胞沉淀，倾去1/3-2/3培养液， 用吸管吹打形成细胞悬液再传代。
贴壁培养
悬浮培养
适合包括原代细胞在内的大多数细胞类 型
适合已适应悬浮培养的细胞以及其他一 些无粘附性的细胞
需要定期传代，但是易于通过倒置显微 镜观察。显微镜下观察形态多种。晃动 培养液时，细胞不动 利用酶或机械方法解离细胞 需要使用经过组织培养处理的容器
较易传代，但是需要每天进行细胞计数 和存活率测定。显微镜下观察呈圆形。 晃动培养液时，细胞也随着漂动 无需通过酶或机械方法解离细胞 可使用未经组织培养处理的容器，但需 进行搅动以便进行充分的气体交换 可批量收获产物，用于蛋白质的大量生 产及多种研究领域
可连续收获产物，用于细胞学研究等多 种研究领域
细胞生长受表面积限制
细胞生长受培养基中浓度的限制
悬浮细胞培养
温度
植物悬浮细胞系：23-27℃
pH
哺乳动物系：7.0-7.4 成纤维细胞系：7.4-7.7
植物细胞：5.6-6.0
培养基
需血清
悬浮培养基可不需血清
5 细胞形态
贴壁培养细胞：成纤维细胞型 上皮细胞型 游走细 胞型 多型细胞型 悬浮培养细胞：悬浮型
生物选择性必修三生物技术与工程第三章动物细胞工程【1】细胞培养是动物细胞工程的基础
探究点二 动物细胞培养的技术流程
下图是动物细胞培养的基本 流程图。据图回答下列问题。
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较,分化程度低的细胞与分化程度 高的细胞比较,哪些细胞更易于培养?为什么? 提示 幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更易培养,原因是这些细胞的分 裂能力强。 2.进行动物细胞培养时,常用胰蛋白酶分散细胞,这说明细胞间的物质除了 水以外主要是什么?能否使用胃蛋白酶处理?为什么? 提示 蛋白质。不能使用胃蛋白酶处理,因为胃蛋白酶的最适pH是1.5左右, 而动物细胞培养液的pH为7.2~7.4,在此环境下,胃蛋白酶无活性。
[探究应用] 1.动物细胞培养需要满足一定的气体环境,下列相关叙述错误的是( ) A.O2的作用是为细胞需氧呼吸提供原料 B.CO2的作用是维持培养液的pH C.通常采用培养皿或松盖培养瓶培养 D.CO2培养箱内应含有95%的O2和5%的CO2 答案 D 解析 CO2培养箱内应含有95%的空气和5%的CO2,D项错误。
2.在进行动物细胞培养时,需要( ) A.用胃蛋白酶处理以获得细胞悬液 B.充入5%的CO2以刺激细胞正常呼吸 C.加入经高压蒸汽灭菌的血清以提供营养 D.定期更换培养液以清除代谢产物
答案 D 解析 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理以获得细胞悬液,A项不符合题意;充入 5%的CO2是为了维持培养液的pH相对稳定,B项不符合题意;加入血清为动 物细胞培养提供营养,高压蒸汽灭菌会破坏血清中的活性成分,C项不符合 题意;定期更换培养液以清除代谢产物,D项符合题意。
特别提醒动物细胞培养的注意事项 (1)动物细胞培养所用的通常是液体培养基,其并非完全的合成培养基,因 为还添加了动物血清等天然成分。 (2)在动物细胞培养过程中,应该对培养液和培养用具进行灭菌而非消毒。 (3)动物细胞培养时,二氧化碳培养箱内应含有5%的CO2和95%的空气,而非 5%的CO2和95%的O2。
细胞传代
贴壁细胞：弃去培养液，加胰酶消化，加培养液终止胰酶作用，吹打成悬液，分装传代。
由于贴壁细胞贴壁生长，接触抑制，长满一瓶后贴壁较紧，不易取出。
这时必须用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理，使其分散开后取出，然后在放入新的培养瓶中培养。
悬浮细胞：离心，弃上清液，加新鲜培养基，分装传代。
悬浮细胞其实也有贴壁现象，只是贴壁不牢。
可以直接用吹打发是细胞掉落下来，进行传代。
传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
传代方法1．悬浮生长细胞传代传代培养中的细胞离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。
常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。
培养材料1、无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,GibcoBRL21600-010)传代培养中的细胞2、trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3、新鲜培养基4、无菌吸管/离心管/培养瓶编辑本段培养步骤1、附着型胞(adherentcell)（1）吸掉旧培养液。
悬浮细胞培养
悬浮细胞培养介绍悬浮细胞培养是一种将细胞以悬浮状态培养的方法。
相对于贴壁细胞培养，悬浮细胞培养能够更好地模拟细胞在体内自由悬浮的环境，适用于许多细胞类型的培养和研究。
悬浮细胞培养技术在生物学、医学和生物工程领域得到了广泛应用。
本文将介绍悬浮细胞培养的基本原理、培养条件和常用的培养方法。
基本原理悬浮细胞培养的基本原理是将细胞以悬浮状态培养在培养基中，培养基提供了细胞生长所需的营养物质和环境因素。
在悬浮培养中，培养基通常包含以下主要组分：1.基础培养液：如DMEM（Dulbecco’s Modified EagleMedium）或RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640），提供细胞生长所需的营养物质，如糖类、氨基酸和维生素等。
2.补充物：根据细胞类型的不同，可以添加血清、生长因子、细胞因子等，以促进细胞生长和增殖。
3.pH缓冲剂和非酶性胎牛血清：用于稳定培养基的pH值和提供额外的营养和辅助因子。
在悬浮细胞培养过程中，细胞应保持以单个细胞的形式悬浮在培养基中，以避免细胞聚集和堆积。
为了实现这一点，通常需要采取一些措施，如定期的细胞传代、培养器皿的选择和培养条件的调节等。
培养条件悬浮细胞培养需要适宜的培养条件来维持细胞的健康生长和增殖。
以下是一些常见的悬浮细胞培养条件：1.培养温度：通常在37°C下培养，但也有一些细胞需要较低的温度，如4°C或30°C。
2.CO2浓度：大多数悬浮细胞培养需要保持适宜的CO2浓度，通常在5%左右。
CO2能够调节培养基的pH 值，提供适宜的细胞生长环境。
3.氧气浓度：氧气浓度对悬浮细胞的生长和代谢有重要影响。
不同类型的细胞对氧气浓度的要求有所不同，一些细胞需要低氧（如2-5%）环境才能生长，而另一些细胞则需要高氧环境。
4.搅拌：悬浮细胞培养过程中需要进行适当的搅拌来保持细胞的均匀分布和培养基中氧气、营养物质的均匀分布。
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13. 加两滴管（约1.8-2mL）冻存液既全面吹打细胞瓶 壁,吹打均匀，细胞浓度宜大，3×106个/mL左右。 14. 将细胞悬液吸至冻存管中，拧好盖，封好胶布，并 标记好细胞种类，冻存时间，保存条件以及冻存者 姓名等（悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液） 15. 在培养瓶(残余少量细胞）中加入5mL完全培养及， 盖好瓶盖（拧紧后并旋回半圈）。做好记录，倒置 相差显微镜下观察细胞的形态，放入CO2培养箱培 养。 16. 冻存管在4度以下存放30min，转放到－20度 1.5－ 2h，再转到－70度4－12h后即可转移到液氮内， 注意做好冻存记录。
10.细胞瓶口靠近火焰打开瓶盖并在酒精灯上烧口消 毒，倒掉或吸出培养基（对于小口的培养瓶可采用 倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出） 11.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，弃胰酶，再加 入一滴管或两滴管胰酶（以盖住细胞量为准，转动 培养瓶，使其湿润整个细胞层，盖好瓶盖。 12.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收 缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起 或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃 胰酶
1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是 关键步骤? 2.细胞胞传代培养的目的是什么? 3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同? 4.如何估计是否传代和传代的方式? 5.细胞冻存应注意的问题。
实验三、细胞的传代与冻存
1.细胞培养中为什么添加血清？
2.使用血清需注意哪些方面？
3.消化液胰酶的浓度是多少？
4.使用小滤器过滤要注意哪些？
针头滤器使用应注意的问题
1.拧紧滤器
2.注射器吸液体 3.注射器插好滤器 4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏 5.如不漏对小瓶过滤。 6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体， 反复多次，滤完。 7.检查滤器滤膜是否完好。
四、实验步骤
1.准备：超净工作台紫外线处理30分钟, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 2. 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要 传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置室温下 预热。 3．关闭超净台紫外灯, 打开可见光灯开关,打开抽风 机清洁空气，除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒 。 4. 正确摆放超净台内的实验用品：酒精灯、酒精棉 球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒（头）、吸管 筒（头）、废液缸等。点燃酒精灯，准备好实验试 剂：DMEM培养基（其中血清含量10%）、 血清、 胰酶等。
5.点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸 管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试 管内。 6.将培养用液（90mL) 瓶口用75%酒精消毒，过酒精 灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7. 打开血清（10.5mL) 瓶，瓶口过酒精灯火焰后斜置 于酒精灯旁的架子上。 8. 无菌吸取 10mL 血清加入到培养液（ 90mL) 中，用 微量移液器加入双抗100μL轻轻混匀，配置完全培 养基。 9. 在血清中（剩余0.5mL) 加入4mL完全培养基轻轻 混匀，加入0.5mL DMSO（冻存保护剂），轻轻混 匀即为冻存液 。
一、实验原理
细胞贴壁过程
培养细胞一代生长过程
什么时候传代？
细胞消化的最佳程度
细胞冻存
要求
冻存条件
操作要点
Hale Waihona Puke 二、实验目的掌握无菌操作技术。
掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。
掌握培养细胞的消化方法。
了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和 生长状况。
三、实验材料及设备
1. 细胞 人宫颈癌HeLa 细胞 人胃癌BGC-823细胞 2. 试剂 胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素 3. 仪器 超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜 4.其它用品： 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸， 75％酒精棉球，酒精灯
注意事项
把握好传代时机，80-90%汇合度阶段最好，过 早细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳 消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞 可脱落流失。 消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞 反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。 不同细胞对消化反应不同。 贴壁不牢—直接吹下—细胞损伤
思考题