细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)
细胞株的复苏、冻存、培养及其基本操作
目录1.目的 (2)2.范围 (2)3.引言、定义和缩略语 (2)4.程序 (2)4.1细胞培养的基本操作 (2)4.2细胞复苏 (3)4.3培养 (3)4.4细胞株冻存 (4)4.5防护 (5)5.登记和归档 (5)5.1登记 (5)5.2归档 (5)6.职责 (5)7.培训 (5)1. 目的本条SOP的目的是规范在体外哺乳动物染色体畸变和基因突变试验的CHL和L5178Y细胞株的冻存、复苏、培养及其相关基本操作规程。
2. 范围本条SOP适用于所有进行该项操作的人员。
3. 引言、定义和缩略语细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物。
4. 程序4.1 细胞培养的基本操作4.1.1 细胞计数体外哺乳动物细胞染色体畸变或基因突变试验中，都需要采用血球计数板进行细胞计数并且该计数结果记录在相应的原始记录中。
4.1.2 细胞清洗4.1.2.1 贴壁细胞的清洗贴壁细胞的清洗是吸出细胞培养物中的原有培养基，加入适当体积（覆盖细胞表层）的Hank`s缓冲液清洗，吸出Hank`s缓冲液。
4.1.2.2 悬浮细胞的清洗悬浮细胞的清洗过程是1000 rpm/min离心细胞培养物5-10mins，弃上清，加入适当体积的Hank`s缓冲液，重悬细胞，1000 rpm/min离心5-10mins，弃上清。
4.1.3 贴壁细胞的消化吸出原有细胞培养液，使用Hank`s清洗细胞1-3次，加入适量的0.25%胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察细胞层直到细胞层发生分散（通常用时5-15分钟），加入含有血清的全培养液，轻轻吹打制备细胞悬液。
备注：在观察细胞消化的过程中，为了避免细胞团块的凝集，不要用力摇晃细胞瓶。
当细胞较难消化时，可将细胞放置在37°C条件下加速消化分离的过程。
4.2 细胞复苏首先将细胞培养基放置在37℃条件预热半小时以上。
将液氮中取出冻存有CHL或L5178Y 细胞株的冻存管迅速放置在37℃水浴锅中。
细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)
背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在—70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中,温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理:细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容(操作步骤）：一、材料（一)仪器1。
净化工作台2. 离心机3。
恒温水浴箱4. 冰箱(4℃、—20℃、—70℃）5。
倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库：http://www.ebioe。
com/yp/product—list-42。
html（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1。
吸头2. 枪头3。
胶塞4。
移液管(10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml)（四)其他物品1。
微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5。
移液枪（五)试剂1。
D—Hanks液2. 小牛血清3。
培养液4。
双抗（青霉素、链霉素）5。
胰蛋白酶(0。
08%）6. 1NHCl7。
7.4%NaHCO38。
DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：http：//www。
ebioe。
com/yp/product-list—43.html二、操作步骤（一）细胞冻存1。
配制含10%DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液;2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、;3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6。
细胞活化与复苏标准操作规程
细胞活化与复苏标准操作规程一、细胞复苏的原则－快速融化必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
二、具体操作1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。
（使用烧杯盛装37度水也可）（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3.迅速解冻（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4.平衡离心（将冻存管中的液体倒入离心管中，加入4ml培养基，离心——除去DMSO）用托盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3min。
5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
7. 培养培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，37℃和5％CO2换液的时间由细胞情况而定。
易犯错误：1. 水浴锅未预热或者未预热到37℃。
2. 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4. 一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
注意事项：对大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。
唯对极少数因对DMSO敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5～10ml培养基中，离心300g(约1000rpm)，5分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，培养箱培养。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。
紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。
贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤嘿，大家好！今天我们来聊聊细胞冻存和复苏的那些事儿，别担心，我会把这些操作讲得通俗易懂，带点幽默感，让你听得轻松又开心。
准备好了吗？那我们就开始吧！1. 细胞冻存的准备工作1.1 细胞的准备首先，细胞冻存之前，你得准备好你的“细胞宝宝”。
这就像给小朋友穿上厚厚的冬衣，你得确保细胞们在冻存前的状态良好。
先要确认细胞生长得旺盛、状态好，这样冻存后复苏才不会掉链子。
别让它们觉得自己快要去北极了，还是要保持好心情哦！1.2 冻存液的配制接下来，你得准备冻存液。
这东西就像给细胞们准备的“冰淇淋”，它的作用是防止细胞在冷冻过程中被冻坏。
通常冻存液里会有含有保护细胞的成分，比如二甲基亚砜（DMSO）或者甘油。
把这些成分混合在一起，就像调制一杯鸡尾酒，让细胞在寒冷中也能有滋有味地待着。
2. 细胞冻存的操作2.1 冻存前的处理冻存的过程开始啦！首先，你得把细胞从培养瓶里取出，像搬家一样，把它们小心放入冻存管里。
记住，操作时要尽量轻柔，别让细胞们觉得自己被“抛弃”了。
然后，把之前准备好的冻存液加入细胞管中，确保每个细胞都得到“冬衣”的保护。
2.2 冷冻过程现在来到了关键一步，冷冻！这个过程就像给细胞们上“冰雪世界”的体验了。
细胞管要放进冷冻箱中，逐渐降低温度，最好是每分钟下降1°C，这样可以防止细胞内形成大的冰晶，保护细胞不受伤害。
记得设置好降温曲线，确保细胞们能平安度过寒冬。
3. 细胞复苏的操作3.1 复苏前的准备好了，细胞们在冷冻中已经度过了漫长的冬季，现在该是复苏的时候了。
首先，你得把冻存管从冷冻箱里取出来，像迎接老朋友一样，准备好温暖的环境。
复苏液的温度要在37°C左右，就像给细胞们提供一个温暖的春天。
3.2 细胞复苏最后一步是复苏！把冻存管放在37°C的水浴中，温柔地摇晃一下，直到细胞液完全融化。
注意啊，动作要轻柔，千万别让细胞感到惊吓。
然后，把细胞转移到预热的培养基中，让它们重新恢复生长。
细胞冷冻及复苏操作流程
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细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)
背景知识：
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特*都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理：
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透*，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：
一、材料
（一）仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
四、操作步骤
（一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二）细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心，1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
五、注意事项
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。
在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。