悬浮细胞培养
悬浮细胞培养流程
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细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
悬浮细胞培养技术在生物研究中的优势与应用
悬浮细胞培养技术在生物研究中的优势与应用随着科技的不断发展，现代生物学研究中的工具和技术也变得越来越复杂和精细。
在这些技术中，悬浮细胞培养技术成为了许多生物学家们关注的焦点。
这种技术可以为生物学研究提供许多优势，从而使得生物学研究在各个方面都得到了突破。
本文将探讨悬浮细胞培养技术在生物研究中的优势和应用，并解析该技术的工作原理以及一些常见的应用案例。
1、什么是悬浮细胞培养技术悬浮细胞培养技术是一种在液体培养基中培养生长的技术。
这种技术主要用于处理无法附着在培养皿上的生物细胞，例如在血液中的白细胞和红细胞等。
这种技术的原理是通过在液体培养基中悬浮细胞生长来探索细胞的各种生物过程。
2、悬浮细胞培养技术的优势悬浮细胞培养技术有以下的优势：(1) 可以处理细胞数量巨大的样本：现代生物研究中，有时需要处理成千上万个细胞样本。
传统的培养技术很难同时处理如此多的细胞数量，但悬浮细胞培养技术能够轻松完成此任务。
(2) 可以监测细胞的各种生物过程：悬浮细胞培养技术提供了一种非常便利和有力的方法，可以研究细胞的各种生物过程，例如分裂、生长、凋亡、和代谢等等。
(3) 可以高效地进行筛选和分离：悬浮细胞培养技术可以使得分离和筛选细胞变得更加高效和便利。
借助一些配合的工具和仪器，可以对样本中的多种细胞类型进行精确分离和筛选。
(4) 可以更好地研究癌细胞：悬浮细胞培养技术被广泛应用于癌症研究中。
癌细胞通常更容易通过悬浮细胞培养技术进行研究。
3、悬浮细胞培养技术的应用悬浮细胞培养技术在生物学研究中有广泛的应用，例如：(1) 抗体生产：悬浮细胞培养技术可以用于生产单克隆抗体。
这种方法可以用于制备高质量的抗体。
(2) 新药筛选：悬浮细胞培养技术可以用于药物筛选的测定。
这种方法可以用来筛选新药物。
(3) 基因表达：悬浮细胞培养技术可以被用来研究基因表达和转录等相关的生物学过程。
(4) 细胞功能研究：悬浮细胞培养技术可以用于探索细胞的生物功能，例如减速的代谢、分裂和凋亡等等。
悬浮培养流程
悬浮培养流程
答案：
1.将准备好的冻存细胞放入37℃水浴中解冻。
2.用70%乙醇对顶端进行消毒，用吸管将细胞转移到含有5miwan全MEM-10培养基的25cm2组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，放入5%C02加湿培养箱中37℃培养过夜。
3.将培养基吸出，用0.5ml37°℃的胰酶/EDTA覆盖细胞，消化30~40s。
4.加入10ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞转移至50ml的离心管中。
室温1800g离心5min，弃上清。
5将细胞沉淀悬浮在5ml的旋转瓶wan全培养基-5中，上下吹打，将细胞团打散。
6.在100ml或200ml通气旋转瓶中加入50ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞悬液转移到瓶中。
7.取出1ml细胞悬液，用血细胞计数器进行细胞计数。
加入适量的旋转瓶wan全培养基-5，使细胞密度为(3~4)x105细胞/m1。
将细胞放入无CO2培养箱，37℃旋转培养，
8.随后的两天让细胞继续生长，并且每天对细胞进行计数，加入适量的旋转瓶wan全培养基-5以维持(3~4)x105细胞/ml的细胞密度
9.取1ml的细胞县液，用血细胞计教器对细胞进行监测。
10.当细胞密度达到(4~5)x105细胞/ml时，隔天或每天用培养基将细胞稀释至1.5x105或2.5x105细胞/ml。
11.分别将装有50ml或100ml细胞县液的100ml或200ml通气旋转瓶放入37℃C无CO2培养箱旋转培养。
每天或隔天传代。
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法：
1. 准备悬浮细胞：首先需要收集悬浮细胞，如白血球、淋巴细胞、骨髓细胞等。
通常，可以采用离心法或者血液透析法来收集悬浮细胞。
2. 培养基准备：根据细胞的种类和需要，选择合适的培养基，加入适量的生长因子、荷尔蒙和营养物质等。
调节培养基的pH值和渗透压等因素，以适应悬浮细胞的生长环境。
3. 培养悬浮细胞：将收集到的悬浮细胞放入已经准备好的培养基中，放入培养箱中进行培养。
注意控制培养箱中的温度、湿度、氧气浓度等因素。
定期更换培养基。
注意事项：
1. 避免过度离心：在离心悬浮细胞的过程中，一定要注意不要离心得太久或太快，以免对悬浮细胞造成不必要的损伤。
2. 控制培养条件：悬浮细胞比较敏感，生长条件的变化会对细胞生长产生影响。
因此，需要掌握培养箱中温度、湿度、氧气浓度等参数，避免不必要的波动。
3. 定期更换培养基：悬浮细胞在培养基中的生长、分裂、代谢需要大量的营养物质和生长因子等，因此需要定期更换培养基，以保持培养基的新鲜度、悬浮细胞的生长状态。
4. 避免感染：元培养含有丰富的营养物质，容易滋生细菌或真菌等，因此需要采取严格的无菌操作，以避免培养基的污染。
悬浮细胞培养步骤
悬浮细胞培养步骤1.概述2.准备培养物料准备所需的培养物料，包括细胞培养基、生长因子、抗生素、试剂等。
3.细胞的分离将已经培养到对数生长期的细胞通过离心等手段分离出来。
将离心得到的胞液中的细胞沉淀，投放到新的培养基中。
4.细胞的计数与调整使用显微镜和细胞计数板，计算细胞密度。
根据实验需要，调整细胞密度，以确保培养物中含有适当数量的细胞。
5.建立悬浮培养体系将调整后的细胞投放到预先消毒的试管、培养瓶或培养皿中。
根据细胞类型和实验需求，选择合适的培养基，并添加所需的生长因子、抗生素等。
确保培养器具和培养基无菌。
6.细胞培养条件的调整调整培养器中的温度、正常气体流量和湿度等参数，以提供细胞正常的生长环境。
通常，悬浮细胞培养中使用37℃的恒温培养箱来维持细胞的正常生长。
7.培养液的补充定期检查培养物的状态，并根据需要添加新鲜的培养液。
培养液的补充应根据细胞增殖速度和细胞密度进行调整。
8.细胞的观察与维护使用显微镜定期观察细胞的形态、细胞密度、细胞内包涵物的存在和其他特征。
根据观察结果，及时进行维护操作，如，在细胞寿命结束后进行细胞分给等。
9.细胞的分离与收获当细胞达到所需的数量或实验结束时，使用离心等方法分离细胞。
根据实验要求，可以通过离心沉淀细胞以获得细胞输植物料，或通过胶体沉淀等方法收集细胞上清液进行后续实验。
10.培养器具和废弃物的处理培养器具应进行彻底的清洗和消毒。
废弃物应根据相关规定进行处置。
总结：悬浮细胞培养是一种重要的细胞培养方法，通过合适的培养条件、定期观察和维护，可以获取到大量的细胞，并用于进一步的实验。
悬浮细胞培养的基本步骤包括细胞的分离、计数与调整、悬浮培养体系的建立、环境条件的调整、培养液的补充、细胞的观察与维护、细胞的分离与收获等。
熟悉这些步骤，并正确操作，能够保证悬浮细胞的正常生长和充分利用。
悬浮细胞培养
悬浮细胞培养介绍悬浮细胞培养是一种将细胞以悬浮状态培养的方法。
相对于贴壁细胞培养，悬浮细胞培养能够更好地模拟细胞在体内自由悬浮的环境，适用于许多细胞类型的培养和研究。
悬浮细胞培养技术在生物学、医学和生物工程领域得到了广泛应用。
本文将介绍悬浮细胞培养的基本原理、培养条件和常用的培养方法。
基本原理悬浮细胞培养的基本原理是将细胞以悬浮状态培养在培养基中，培养基提供了细胞生长所需的营养物质和环境因素。
在悬浮培养中，培养基通常包含以下主要组分：1.基础培养液：如DMEM（Dulbecco’s Modified EagleMedium）或RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640），提供细胞生长所需的营养物质，如糖类、氨基酸和维生素等。
2.补充物：根据细胞类型的不同，可以添加血清、生长因子、细胞因子等，以促进细胞生长和增殖。
3.pH缓冲剂和非酶性胎牛血清：用于稳定培养基的pH值和提供额外的营养和辅助因子。
在悬浮细胞培养过程中，细胞应保持以单个细胞的形式悬浮在培养基中，以避免细胞聚集和堆积。
为了实现这一点，通常需要采取一些措施，如定期的细胞传代、培养器皿的选择和培养条件的调节等。
培养条件悬浮细胞培养需要适宜的培养条件来维持细胞的健康生长和增殖。
以下是一些常见的悬浮细胞培养条件：1.培养温度：通常在37°C下培养，但也有一些细胞需要较低的温度，如4°C或30°C。
2.CO2浓度：大多数悬浮细胞培养需要保持适宜的CO2浓度，通常在5%左右。
CO2能够调节培养基的pH 值，提供适宜的细胞生长环境。
3.氧气浓度：氧气浓度对悬浮细胞的生长和代谢有重要影响。
不同类型的细胞对氧气浓度的要求有所不同，一些细胞需要低氧（如2-5%）环境才能生长，而另一些细胞则需要高氧环境。
4.搅拌：悬浮细胞培养过程中需要进行适当的搅拌来保持细胞的均匀分布和培养基中氧气、营养物质的均匀分布。
细胞悬浮培养技术操作方法
细胞悬浮培养技术操作方法细胞悬浮培养技术是一种将细胞悬浮在培养基中进行培养的方法，通常使用铺底培养法（adherent culture）相反。
这种培养方法适用于需要大量细胞且细胞生长速度快的细胞类型，比如淋巴细胞、白血病细胞、肝细胞等细胞线。
本文将介绍细胞悬浮培养技术的操作方法。
1. 培养基的准备细胞的悬浮培养需要用到特殊的培养基。
培养基通常包含以下组成部分：基础培养液、生长因子、血清、抗生素等。
基础培养液是细胞生长所必须的营养成分，生长因子可促进细胞增殖和分化，血清可以为细胞提供必要的营养成分，抗生素则可消除培养基中的细菌等外来微生物，以保证细胞的无菌培养。
准备培养基时要根据细胞类型的不同选择不同的基础培养液和生长因子，培养中要注意保持无菌环境。
2. 细胞的预处理在采集细胞之前，要先对细胞进行预处理。
一般步骤如下：（1）将细胞与培养基混合，然后放入离心管中离心，去掉上层液体，取出细胞沉淀。
（2）用PBS洗涤两次，去除多余的培养基和血清成分。
（3）计算细胞的浓度和活性。
（4）按需要调节细胞浓度，如需稀释时，可添加相应的培养基和血清，不要直接加水。
3. 细胞的培养（1）将经过预处理的细胞放入含有培养基的离心管中，并混匀。
（2）将细胞悬液转移至无菌的试管中，每支试管放入适量的细胞数，通常为1x106/mL。
（3）将试管放入恒温摇床或培养箱中，控制温度和CO2颓量，使其保持适宜的生长环境。
保持培养液离开平均氧化还原电位和pH，避免造成对细胞的损害。
（4）细胞的分裂时间根据不同的细胞类型而不同。
在培养过程中，要不断观察细胞的生长状况，检查并确保细胞数量不会超过最大容纳量。
培养时间的长度也根据细胞类型的不同而不同，一般为数天到数周不等。
4. 细胞提取经过一段时间的培养，细胞数量逐渐增多。
在细胞提取之前，需要先收集细胞。
收集过程如下：（1）取出培养的试管，用离心管小心地沉淀细胞。
（2）将上清部分取出，留下沉淀的细胞。
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1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
8
继代
9
② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
10
③最佳继代时期：
第五章 悬浮细胞培养
1
主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
2
悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
③ FDA法
24
①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
25
FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7
21
血球计数板
计数室
每毫升样品中细胞数 每小格细胞平均数 × 4000 × 1000 × 稀释倍数
22
③细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培 养基，真空抽虑，称重。 ④细胞干重： 60℃干燥12小时后，以 每毫升培养物或106个细胞的重量表 示。
23
4、培养细胞活力的测定
① 相差显微术法
② 伊凡蓝法
3
步骤：
悬浮培养
继代
悬浮
摇床用于振荡
优点：细胞团成小 细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分 布；有空气交流。 4
一、起始悬浮细胞的制备
转速30-150rpm
防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
5
6
二、悬浮培养的基本形式
26
植物细胞代谢调节的研究（某种生长限 速浓度－细胞生长的影响）； 次生物质的大量生产。
19
3、悬浮培养中细胞生长量的计算
① 细胞计数
② 细胞密实体积
③ 细胞鲜重
④ 细胞干重
20
①细胞计数
5％铬酸或0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散 用血球计数板计数。
②细胞密实体积（PCV）
将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，2000转下离心收集细胞， 用每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
①开放式和封闭式区
别 封闭式中：排出液中的细胞用机械方法（离
心）收集后，又放入原培养基，所以其培养细 胞数目不断增加
开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养 细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持 恒定
通过调节流入和流出的速度，使培养物的 生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上
18
②连续培养意义：
14
⑤ 意义：
它是进行细胞生长和细胞分裂的生理
生化研究常用的培养方法。
但要进行下一批培养、连续培养 （Continuous culture）
16
加入培养基
二者体积相等
排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养（Open C.C）
17
封闭式连续培养（Closed C.C）
了解细胞数目增长变化S形曲线后，
选择对数生长期和直线 生长期！
11
培 养 细 胞 数 目
S形曲线
5
4
3 1
2
培养时间
12
培 养 细 胞 数 目 3
5 4
1
2 培养时间
1 滞后期
2 3 4 5
对数生长期
直线生长期 缓慢期 静止期
13
④操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔 径要小，只能通过单细胞或小细胞团 （2- 4细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细 胞团沉降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮 培养物。