实验3---悬浮细胞的培养
第三章 植物细胞的悬浮培养
二. 操作程序
（五）悬浮培养
2克鲜重疏松易碎的愈伤组织放入盛有20～40ml
液体培养基的三角瓶中，在摇床上120转/分， 25±1℃，黑暗或弱光下培养，2～3d更换新鲜 培养基，注意细胞与培养基之间的比例。原有 培养基与新鲜培养基比例为1：3。
二. 操作序
（六）悬浮细胞的继代培养与选择 要得到均一的悬浮系，常用的方法有三种： 一是每次更换培养基时将培养物摇匀，稍静片刻，将上层培养 基连同其中的小细胞团倒入另一无菌三角瓶中，弃去底部愈伤 组织块或大细胞团，再待小细胞沉入瓶底，弃去大部分培养基， 加入新鲜培养基。 二是将培养物摇匀，静置片刻，用吸管取培养基中部的培养物， 加入另一无菌三角瓶中，后加入新鲜培养基。 三是过滤，将培养物通过一定孔径的尼龙网或不锈钢网 （520um左右）过滤，尔后收集小细胞团进行继代培养。 上述三种方法可结合使用，继代一段时间后便可进行一次筛选， 直至建立起分散性良好、均一、生长迅速的悬浮细胞系为止。
实例
白木香
二. 操作程序
（十）悬浮细胞的分散度、生长速度与植株再生能力之间的关 系 一般来讲，如果一个悬浮细胞系分散程度越高，生长速度越快， 在一定时间内，细胞分裂的代数也就越多，也就越易产生突变， 其分化能力也就越容易丧失，因此，悬浮细胞在继代培养过程 中，每隔一段时间（1～2个月）就应检查一下它的分化能力。 自诱导愈伤组织到建立一个良好的悬浮细胞系大约需要4～6个 月或更长的时间，因此尽量保持其分化能力极为重要。 保持其分化能力的方法有二个：超低温保存是一个极有效的方 法，经过超低温保存的悬浮细胞，不会影响其各种性质，同对 照组相同。 固体培养基上保持悬浮细胞的分化能力。
二. 操作程序
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
293悬浮细胞SOP
293悬浮细胞转染标准操作规程1.0 目的：规范293悬浮细胞转染相关操作，保证293悬浮细胞转染工作正常进行,确保获得高表达的293工程细胞。
2.0 适用范围：适用于生物部日常293悬浮细胞转染相关实验。
3.0 工作程序：3.1细胞复苏：操作者按照《哺乳动物细胞复苏标准操作规程》要求，复苏293悬浮细胞于25CM2培养瓶中，培养体积为5-7ml，放CO2培养箱，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。
3.2培养3-5天，细胞长满后，用移液管反复吹打细胞，使细胞重悬，将细胞悬液转至15ml 离心管，1000rpm离心3min。
3.3用无菌移液管轻轻将离心后的上清吸出，加入20ml新培养基，吹打、重悬细胞，将细胞悬液转入2个25CM2培养瓶，每个培养瓶10ml，放CO2培养箱，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。
3.4当细胞密度长到2×106cells/ml左右时，用无菌移液管吹打培养瓶内的细胞，是细胞重新悬浮成单个细胞，将细胞转至125ml细胞摇瓶中，补充新鲜培养基至30ml，放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。
3.5培养3-4天，细胞密度达到1×106cells/ml左右时，收集细胞悬液，1000rpm离心3min。
3.6弃上清，用60ml新鲜培养基重悬细胞，将细胞转至250ml细胞摇瓶中，放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%，摇床转速为125rpm。
3.7培养2-3天，细胞密度达到2×106cells/ml左右时，1:3传代至新摇瓶，传代后细胞密度为5-6×105cells/ml，摇瓶放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%，摇床转速为125rpm。
3.8培养1-2天，细胞密度达到1-1.2×106cells/ml左右时，进行转染。
3.9质粒DNA中加入0.5-3ml不等的70%乙醇，10000rpm离心5min，吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，室温晾干。
植物细胞悬浮培养的方法
植物细胞悬浮培养的方法植物细胞悬浮培养是一种常用的细胞培养方法，它可以用于研究植物细胞的生长、分化和代谢等方面的问题。
本文将介绍植物细胞悬浮培养的基本原理、培养条件和应用。
一、植物细胞悬浮培养的基本原理植物细胞悬浮培养是将植物细胞从组织中分离出来，以液体培养基为基质，在适宜的温度、光照和气体条件下进行培养。
悬浮培养的优势在于可以提供细胞自由生长的环境，有利于探究植物细胞的生理和生化特性。
二、植物细胞悬浮培养的培养条件1. 培养基：植物细胞悬浮培养的基础是培养基的选择。
培养基中应含有适宜的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和维生素等。
常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
2. 温度：植物细胞的适宜生长温度通常在20-25摄氏度之间，不同植物细胞可能有所差异，需要根据具体情况进行调整。
3. 光照：光照条件对植物细胞的生长和代谢有一定影响。
一般情况下，光照强度为1000-2000勒克斯，光周期为16小时光照/8小时黑暗。
4. 气体：植物细胞悬浮培养通常需要提供充足的氧气和适量的二氧化碳。
因此，培养容器应具有良好的通气性，可以使用摇床或气体通气系统进行培养。
三、植物细胞悬浮培养的应用植物细胞悬浮培养在植物生理学、生物工程和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
1. 植物生理学研究：植物细胞悬浮培养可以用于研究植物的生长发育过程，如细胞分裂、细胞扩增和细胞器的形成等。
2. 生物工程：植物细胞悬浮培养可以用于生物工程的研究和应用，如基因转化、蛋白质表达和次生代谢产物的生产等。
3. 药物研发：植物细胞悬浮培养可以用于药物的筛选和生产，如植物次生代谢产物的提取和纯化，以及药物的生物活性和毒性测试等。
四、植物细胞悬浮培养的优缺点1. 优点：(1) 与传统的植物培养相比，悬浮培养提供了更便利的细胞生长环境，可以快速获得大量的细胞。
(2) 可以对植物细胞的生理和代谢进行深入研究。
(3) 可以为生物工程和药物研发等领域提供重要的研究手段和应用平台。
悬浮培养细胞生长的计量42
第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
2，细胞悬浮培养的培养基
提高2,4-D的浓度和降低分裂素的浓度能够提高悬浮 细胞的分散程度； 悬浮培养的细胞对维生素和氨基酸的有比较明显的 更大量的需求； 无机磷酸盐的消耗比较快，加大无机磷酸盐的浓度 （3-5倍）可以维持细胞系较长时间的稳定增殖； B5和ER（Eriksson，1965）是两种典型的液体培养 基。
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
3，细胞悬浮培养的特点
3.1 不用使用琼脂等培养基固化剂，不仅减少 成本而且能使培养结果不受固化剂中杂质的影 响。 3.2 便于更换培养基的操作，借此可以减少人 工劳力。 3.3 在液体培养条件下植物组织失去了生长的 方向性。
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
3，细胞悬浮培养的特点
第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
1，细胞悬浮培养的方法
1.1，摇床和三角瓶 一般细胞增殖、营养生理等研 究、细胞分裂同步化、细胞再分化（胚胎发生）的 研究、原生质体供体材料的准备等。 1.2，转轮和试管液体培养 与1.1相似但较少用
1.3，悬滴培养 单细胞或少量的原生质体或原生 质体融合后的杂种细胞等； 1.4，发酵罐培养 用于进行次生代谢物质生产的 悬浮培养；
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
5，悬浮培养体系的应用
5.1，悬浮培养细胞的同步化 化学的方式有饥饿法和抑制法两种方法。 饥饿法是对细胞断绝供应一种细胞分裂所必需的营 养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，然后，重 新在培养基中加入这种限制因子，这些静止的细胞 就会同时进入细胞分裂的相同阶段。 抑制法是加入一些抑制性的物质使细胞分裂停止进 行，然后除去这些物质使细胞同时重新开始分裂。
细胞悬浮培养
4.选择单细胞和小细胞团进行继代 选择单细胞和小细胞团进行继代
在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注 射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 射器 ， 但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 胞和小细胞团（ 胞和小细胞团 （ (2-4 个细胞 ） ， 而不能通过大的 个细胞） 细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒， 细胞聚集体。 继代前应先使三角瓶静置数秒 ， 以 便让大的细胞团沉降下去， 便让大的细胞团沉降下去 ， 然后再由上层吸取悬 浮液。 浮液。
悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 物理方法和化学方法。 物理方法和化学方法。 物理方法主要是通过对细胞物理特性 物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细 主要是通过对细胞物理特性（ 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等） 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 进行选择的方法和低温休克法等。 进行选择的方法和低温休克法等。
5.4 细胞增殖的测定
1. 细胞鲜重 将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的 湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去 湿尼龙丝网上，用水洗去培养基， 细胞上沾着的多余水分，称重， 细胞上沾着的多余水分，称重，即求得细胞鲜重 （fresh weight）。 weight）。
2.细胞干重 2.细胞干重 用已知重量的干尼龙丝网依1的方法收集细胞， 用已知重量的干尼龙丝网依1的方法收集细胞， 在60℃下干燥48 h或80℃下干燥36 h，细胞干重恒 60℃下干燥48 h或80℃下干燥36 h， 定后，再称重。细胞干重（ weight） 定后，再称重。细胞干重（dry weight）以每毫升 培养物或每10 个细胞的重量表示。 培养物或每106个细胞的重量表示。
南昌大学植物生物技术期末考试重点
1.组织培养：是指通过无菌操作分离植物体的一部分接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。
继代培养：指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。
2.单倍体培养：单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染色体数目和配子体细胞染色体数目一致，因此可以从其“表型”观察“基因型”。
利用这一特点在杂交育种中可以提高选择效率，避免误选和漏选。
对单倍体植物进行染色体人工加倍之后，即可得到同质结合的纯系，使育成的杂种不再分离，缩短育种年限，加快育种速度。
3.悬浮细胞培养定义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养步骤：选择外植体---诱导疏松易碎的愈伤组织---悬浮继代培养---悬浮细胞同步化---细胞计数与活力测定三个条件：分散性良好、均一性好、生长迅速特点：1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
4.花粉培养与花药培养一、从概念来看，花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。
花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体，且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。
二、从培养层次来看，花药离体培养属器官培养，花粉离体培养属细胞培养，但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。
三、从培养过程来看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功。
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法和注意事项悬浮细胞培养方法和注意事项悬浮细胞培养是一种将细胞悬浮于培养基中进行培养的方法。
这种方法通常用于培养悬浮生长的细胞，如血液中的白细胞、淋巴细胞等。
下面将介绍悬浮细胞培养的方法和注意事项。
1. 准备培养基和细胞首先要准备适合的培养基和细胞。
培养基的选择要根据细胞的需求来选取，一般要添加适量的血清、营养物质等，以满足细胞的生长和分裂需求。
细胞的获取可以通过酶消化、机械剪切等方式获得，注意要保持细胞的完整性和活力。
2. 调整细胞密度将细胞悬浮于培养基中前，需要对细胞密度进行调整。
一般来说，细胞密度应该控制在适当的范围内，过高或过低都会影响细胞的生长和分裂。
可以通过显微镜观察来确定细胞密度，或者使用自动化细胞计数器进行计数。
3. 培养细胞将细胞悬浮于培养基中，放置在恒温恒湿的细胞培养箱中。
要定时观察细胞的生长情况，调整培养基或细胞密度，以满足细胞的需要。
此外，还要注意培养箱的清洁和消毒，以避免细菌和其他微生物的污染。
4. 注意事项在进行悬浮细胞培养时，要注意以下几点：- 细胞密度控制：过高或过低的细胞密度都会影响细胞的生长和分裂，要控制在适当的范围内。
- 培养基选择：不同的细胞对培养基的要求不同，要选择适合的培养基。
- 细胞活力：细胞的获取和处理过程中要注意保持细胞的完整性和活力。
- 消毒措施：细胞培养箱的清洁和消毒很重要，要避免微生物的污染。
- 观察和调整：定时观察细胞的生长情况，及时调整培养基或细胞密度，以满足细胞的需要。
总之，悬浮细胞培养是一种有效的细胞培养方法，但要注意细胞密度、培养基选择、细胞活力、消毒措施等方面的问题。
只有在细心认真的操作下，才能获得高质量的细胞培养物。
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本科学生实验报告
姓名王冬梅学院＿生命科学学院＿＿＿专业＿应用生物教育＿班级＿＿08应生A班＿＿＿实验课程名称＿＿＿植物组培实验＿＿＿＿＿＿＿＿＿指导教师及职称＿龙维彪＿＿
开课学期2010 至＿2011 学年＿下＿学期上课时间2011年3月~ 6月
云南师范大学教务处编印
实验三：胡萝卜细胞的悬浮培养
一、实验目的：
了解植物细胞悬浮培养的基本原理，通过实验掌握植物细胞悬浮培养的方法和技术。
并通过实验练习和巩固无菌操作技术
二、基本原理
利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。
但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。
这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。
在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。
由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。
在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。
在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。
若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。
三、器材
超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶等。
四、操作步骤：
胡萝卜细胞的悬浮培养培养基的配制
配方：MS+RT(0.5mg/l)+2,4-D(1)+LH(100)+C(30g/l) PH:5.8 胡萝卜细胞的悬浮培养
将前面培养好的胡萝卜愈伤组织。
如下：
挑选增殖良好的转移到200ml的三角瓶中，瓶内装有一定量的液体培养基，将三角瓶置于摇床上，转速100r/min,25℃下光照培养。
进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞生长速度有关，因此当发现培养瓶中培养物密度较大时，应及时用无菌的吸管吸取部分培养物到一新的50mL 培养基中继续培养。
同时还要及时淘汰一些大的组织团块和黄褐色的坏死组织。
一般每隔4～7d 就要继代一次。
本次实验基本成功，但其中也有不足之处，所以需要再接再厉，做得更好。
不足之处：
经观察悬浮培养基中的细胞碎片较多，这可能是摇床的速度偏大导致，所以适当降低转速估计可以降低细胞的碎片。
组织培养当中的无菌操作是必须条件，养成良好的习惯对实验的成败十分有帮助，所以应注意无菌操作技术的熟练。
同时，在悬浮培养当中要注意实验阶段
各个环节的细节，使细胞悬浮培养达到最优的效果。