胶体金免疫层析试验须注意的几个问题

胶体金免疫层析试验须注意的几个问题1971年，Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。

1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。

此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快[1]。

目前在医学检验中的应用主要是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay GICA）和胶体金免疫渗滤法（gold immunofiltration assay GIFA）。

1990年Beggs[2]和Osikowicz[3]等相继建立了免疫层析试验。

胶体金免疫层析试验是将各种反应试剂分点固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上移行并与膜上另一种试剂接触，标本中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。

层析过程中免疫复合物被聚集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。

而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。

其特点是单份测定、简单、快速，除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。

目前已在临床检测中获得广泛应用，极大地简化了检验步骤，同时，也给试纸条制备者带来了一定的难度。

胶体金免疫层析试纸条有十几种原材料及辅助材料组成，要想达到临床要求需作大量的试验，根据我们多年的工作经验，现就胶体金免疫层析试验过程中必须注意的几个关键问题作以介绍。

1 胶体金颗粒大小的选择
胶体金颗粒的大小与产品的灵敏度及特异性有关。

我们制备了如下胶体金液体各100ml，0.01％氯金酸水溶液中加入1％柠檬酸三钠的量分别为：①1.0ml；②1.5ml；③2.0ml；④2.5ml。

各取其50ml，调PH值为6.9进行抗HBsAg抗体标记,分别做灵敏度及特异性实验,结果见表1。

由表1可看出：胶体金颗粒越大，灵敏度越高，但特异性越差。

在胶体金免疫层析试
验时，我们既要灵敏度高，又要特异性强，所以，我们在选择胶体金颗粒的大小时应慎重。

2 最佳pH值的选择
胶体金与蛋白质的结合成功与否，与胶体金溶液的pH值有很大关系。

胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果等于或低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。

如果pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷产生排斥而不能互相结合。

我们将已制备好的胶体金用0.1M K2CO3调不同的pH，各取1ml分别放在不同的试管内，加入抗HBsAg单抗，5分钟后分别加入0.1ml 10％NaCl，混匀后静止2hr，离心，结果见表2，最适pH为6.9[4]。

由表2看出，随着pH值的升高，其灵敏度会下降，一般来说，能使标记后离心沉淀物完全溶解的最低pH再加0.1－0.2即为标记物的最佳pH值。

不同的抗原及抗体其等电点不同，操作中一定要认真试验，选择合适的pH值。

3 最佳蛋白量的选择
标记蛋白的量对胶体金的稳定性起决定作用。

我们将抗HBsAg单抗稀释为不同浓度，分别加入装有1ml胶体金的试管内，5分钟后分别加入0.1ml 10％NaCl，混匀后静止2hr，离心，结果见表3，最佳标记蛋白量为11μg/ml。

由表3可看出：未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，胶体金标记物离心后呈现由完全不溶到部分溶解的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金标记物的离心后完全溶解。

其中含蛋白量最低胶体金标记物离心后完全溶解的试管即含稳定1ml胶体金的必须蛋白量，在此基础上再
加上20%即为稳定所需蛋白质的实际用量。

标记蛋白的量对胶体金的稳定性起决定作用。

为了达到最高的标记率又不致于浪费原材料增加成本，应根据不同的产品选择不同的最佳蛋白标记量。

4 微孔滤膜的选择
微孔滤膜是胶体金免疫层析试验中的一种重要原材料，起载体作用。

微孔滤膜与免疫层析试验中灵敏度、特异性、本底及速度有很大关系。

微孔滤膜根据其实用的基础材料不同而有多种类型。

如硝酸纤维膜（NC），醋酸纤维模，尼龙膜，PVDF膜，硝酸、醋酸混合膜等，其中NC膜和尼龙膜的蛋白结合能力较强，但尼龙膜易产生较重的本底，故一般选择NC膜作为包被载体。

蛋白质的结合能力不仅与微孔滤膜的原材料有关，而且与膜的孔径有关。

一般来讲膜孔径越小，蛋白结合能力越大，但液体的迁移速度越小；膜孔径越大，蛋白结合能力越小而液体的迁移速度越大，所以在筛选NC膜时，不仅要考虑膜吸附蛋白的能力，而且要考虑含有胶体金颗粒的液体在膜上的迁移速度。

我们曾对上海、北京、美国、德国等国内外不同厂家生产的NC膜进行试验。

结果见表4。

从表4可以看出，NC膜与灵敏度、特异性、本底及速度的关系，因此，在实际选择NC膜的过程中，应综合考虑，既要顾及产品的灵敏度，又要顾及其特异性、本底及迁移速度，选择不同的产品最适宜的NC膜。

5 包被浓度的选择
胶体金免疫层析试纸条在NC膜上一般划有两条线，一条检测线，包被有抗体（抗原），用于捕捉样品中的抗原（抗体）；另一条是质控线，用于测试条本身的质控。

将纯化的抗CEA单抗和兔抗鼠IgG分别用0.1、0.5、1、2、4、6mg/ml的浓度划线点样，与同一批冻干金标结合物玻璃纤维装配成试纸条。

结果见表5。

由表5可看出，如果包被浓度太低，其灵敏度不够，质控线不深。

采用抗CEA单抗2mg/ml、兔抗鼠IgG 4mg/ml 的包被量即可满足所需灵敏度的要求，增加包被抗体的浓度不能提高测试灵敏度。

增加兔抗
鼠IgG的浓度反而会影响其特异性，这是因为兔抗鼠IgG的浓度过高，NC膜包被线已达到饱和，多余的兔抗鼠IgG在膜的处理过程中，很容易脱落进入液体内到达检测线位置而与抗CEA单抗结合，从而造成假阳性。

因此，在胶体金免疫层析试验选择抗体或抗原的包被浓度时，为了达到检测的高灵敏度及特异性而又不致于浪费原材料增大成本，应选择一组合适的包被浓度。

在胶体金免疫层析试验中，除上述几点外，与此相关的其他内容如筛选和纯化抗体、胶体金标记物的制备及干燥、抗体包被的温度及时间、封闭液及封闭温度及时间的选择以及选择助溶剂等，也是不容忽视的重要环节。

胶体金免疫层析试验是一个非常复杂的过程，十几种原辅料均集中在一个试纸条上，并且样品在反应过程中没有洗涤，时间很短就完成，这就要求试纸条不仅要有很高的灵敏度，而且要有很好的特异性。

作为科技工作者，必须以严谨的科学态度，对不同产品的每一步骤、每一环节以及每一种原辅材料，进行大量的、科学的试验，才能制备出符合临床要求的高质量的胶体金免疫层析试纸条。

参考文献
1 沈关心，周汝麟主编等.现代免疫学实验技术，第1版，湖北科学技术出版社，1998：131
2 Beggs M,Novotny M,Sampedro S,etal. A self-performing chromatographic immunoassay for the qualitative determination of human chorionic gonadotrophic(HCG) in urine and serum. Clin Chem. 1990; 36:1084.
3 Osikowicz G, Begge M. One-step chromatographic immunoassay for qualitative determination of choriogonadotropin in urine. Clin Chem.1990,36:1586.
4 马丽丽，王玉金，杨书豪等.快速乙肝表面抗原胶体金免疫层析测定法的建立及应用，标记免疫分析与临床，1997，4（4）：225－227.。