2 文库定量流程-KAPA Library Quantifcation Kit
定量分析一般步骤
总之，要根据试样的性质，分析项目要求和上述原则，选择一种合适的试样分解方法。
试样分解最好结合干扰组分的分离，简单、快速进行测定
水样
用泵将气体充入取样容器；采用装有固体吸附剂或过滤器的装置收集；过滤法用于收集气溶胶中的非挥发性组分
固体吸附剂采样：是让一定量气体通过装有吸附剂颗粒的装置，收集非挥发性物质
大气试样，根据被测组分在空气中存在的状态(气态、蒸气或气溶胶)、浓度以及测定方法的灵敏度，可用直接法或浓缩法取样
贮存于大容器(如贮气柜或槽)内的物料，因密度不同可能影响其均匀性时，应在上、中、下等不同处采取部分试样后混匀
其中：
采样公式:
试样多样化，不均匀试样应，选取不同部位进行采样，以保证所采试样的代表性。
土壤样品: 采集深度0-15cm的表地为试样，按3点式(水田出口，入口和中心点)或5点式(两条对角线交叉点和对角线的其它4个等分点)取样。每点采1-2kg，经压碎、风干、粉碎、过筛、缩分等步骤，取粒径小于0.5 mm的样品作分析试样。 沉积物: 用采泥器从表面往下每隔1米取一个试样，经压碎、风干、粉碎、过筛、缩分，取小于0.5 mm的样品作分析试样。 金属试样: 经高温熔炼，比较均匀，钢片可任取。对钢锭和铸铁，钻取几个不同点和深度取样，将钻屑置于冲击钵中捣碎混匀作分析试样。
用射频放电来产生活性氧游离基，这种游离基的
活性很强，能在低温下（100℃）分解有机物和生物物质
干式灰化法的优点是不需加入或只加入少量试剂，这样避免了由外部引入的杂质，而且方法简便
缺点是因少数元素（C,I,Br,Hg)挥发或器皿壁上玷附金属而造成损失
将试样与硝酸和硫酸混合物一起置于克氏烧瓶内，煮解，硝酸能破坏大部分有机物和被蒸发，最后剩余硫酸冒浓厚的SO3白烟时，在烧瓶内进行回流，溶液变为透明 用体积比为3：1：1的硝酸、高氯酸和硫酸的混合物进行消化，能收到更好的效果 湿式消化法的优点是速度快，缺点是因加入试剂而引入杂质，尽可能使用高纯度的试剂
定量测量操作教程
波长：546.0nm
09：21：19 D2 W
系统主菜单
①光度计模式 ②定量测量 ③光谱扫描 ④动力学测量 ⑤DNA/蛋白质测量 取消 上翻 下翻 选取
主菜单界面下，通过向下”方向键“，或”下翻“功能键，选择”定量测量“。
ENTER 点击“选取”功能键，或点
，进入“定量测量”。
波长：546.0nm 定量测试
Abs
09：21：19 D2
ID Conc.（mg/L）
1
0.000
W 波长（nm） 450.0
C = 1.000+1.000*A^1 拟合方法 系数
r = 1.000 标样设定 曲线
在“拟合方法”内选择“线性拟合后”，此处方程即变为线性方程 拟合方法”内选择“线性拟合后”
标样法做曲线
波长：546.0nm 定量测试
检索 C = 1.000+1.000*A^1 请输入标样含量：1_ r = 1.000
2号样品的浓度数值 号样品的浓度数值
波长：546.0nm 标样含量设置
Abs：
Abs
09：21：19 D2 W 波长（nm） 450.0
ID Conc.（mg/L）
1 2
0.000 0.000
检索 C = 1.000+1.000*A^1 请输入标样含量：1_ 输入完毕后，点击
C = 0.000*A^1 单位
r = NaN
拟合曲线
波长：546.0nm 定量测试
ID
Abs：
Abs Conc.（mg/L）
09：21：19 D2 W 波长（nm） 546.0
当前方程
检索 翻滚 C = 0.000*A^1 单位 r = NaN
定量分析的一般步骤Ⅰ
根据选定的模型类型，建立相应的模型方程，将数据 与模型进行拟合。
参数估计
使用统计方法对模型参数进行估计和优化，以提高模 型的拟合效果。
模型检验与优化
模型检验
使用适当的统计方法检验模型的假设 和前提条件是否满足。
模型优化
根据检验结果对模型进行优化和调整， 以提高模型的预测能力和解释力。
模型评估
目的和意义
目的
通过定量分析，探究变量之间的关系，预测未来趋势，为决策提供科学依据。
意义
定量分析能够提供客观、准确的数据支持，有助于提高决策的科学性和准确性，促进各领域的科学研究和发展。
02 定量分析的基本概念
定义与特点
定义
定量分析是一种基于数学和逻辑推理 的方法，通过收集和整理数据，运用 适当的统计和数学工具进行分析，以 揭示数据背后的规律和趋势。
• 进一步发展复杂统计模型和方法：针对复杂的数据结构和动态性，发展更先进 的统计模型和方法，以提高预测和决策的准确性。
• 强化数据科学的研究和应用：加强数据挖掘、机器学习和人工智能等技术在定 量分析中的应用，以更好地处理大规模、高维度的数据。
研究展望
跨学科研究的融合
加强与其他学科的交叉融合，如计算机科学、经济学、环境科学等，以拓展定 量分析的应用领域和解决更复杂的问题。
数据降维
将多个相关变量转化为少数几个不相关的主 成分，降低数据集的维度。
多元可视化
将高维数据降维后，更容易进行数据的可视 化分析。
解释性
主成分能够反映原始变量的主要特征和变化 趋势，有助于解释数据的内在结构。
评估指标
通过计算主成分的方差贡献率，确定每个主 成分的重要程度。
聚类分析
定量分析的一般步骤Ⅰ
较均匀的粉状固体或液体
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-7
2.组成很不均匀的物料
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-8 根据矿石的堆放情况和颗粒的大小来选取合理的取样点及采集量。 Q为所需试样的最小质量，单位为kg； K为缩分系数，试样均匀度越差， K值越大 d为试样的最大粒度（直径，单位mm） 将采集到的试样经过多次破碎、过筛、混匀、缩分后才能得到符合分析要求的试样。
1.1 取样的基本原则
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-3
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-4
14-1 试样的采取和制备
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得其反。正如我们都希望改变世界，希望给别人带去光明，但更多时候我们只需要播下一颗种子，自然有微风吹拂，雨露滋养。恰如其分地表达观点，往往事半功倍。当您的内容到达这个限度时，或许已经不纯粹作用于演示，极大可能运用于阅读领域；无论是传播观点、知识分享还是汇报工作，内容的详尽固然重要，但请一定注意信息框架的清晰，这样才能使内容层次分明，页面简洁易读。如果您的内容确实非常重要又难以精简，也请使用分段处理，对内容进行简单的梳理和提炼，这样会使逻辑框架相对清晰。
14-3 测定方法的选择
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-1 定量分析大致包括以下几个步骤：取样、试样的分解、干扰组分的分离、测定、数据处理及分析结果的表示。
测定的具体要求 欲测组分的含量范围 待测组分的性质 共存组分的影响 实验室条件
定量分析的一般步骤
表14-1 标准筛的筛号和孔径 缩分的目的：使粉碎后的试样量逐渐减少，一 般采用四分法。
例 题 :有 试 样 2 0 k g ， 粗 碎 后 最 大 粒 度 为 6 m m 左
筛号/目 3 6 10 20 40 60 80 100 120 140 200
右 ， 设 K 值 为 0 .2 ， 应 保 留 试 样 量 为 多 少 ?
03
酸性熔剂K2S2O7（熔点419 ℃）、KHSO4（熔点219℃）溶解碱性试样
灼烧时
2KHSO4=K2S2O7＋H2O
04
分解金红石 TiO2 + 2K2S2O7 = Ti(SO4)2 + 2K2SO4
✓ 碱熔法
碱性熔剂Na2CO3 ,K2CO3 ,NaOH ,KOH, Na2O2 或混合 例: 钠长石
要采取一系列减小误差的措施，对整个分析过程进
01
行质量控制 要采用行之有效的方法对分析结果进行评价，及时
ห้องสมุดไป่ตู้02
发现分析过程中的问题，确保分析结果的可靠性 03 14-4 分析结果准确度的保证和评价
分析结果的评价（对分析结果是否“可取”作出判断）
实验室内的质量评价
实验室间的质量评价
○ 对于一种新的试验方法，要检查其准确度和精密度 ● 在工业生产的质量控制和日常分析测试数据的有效性检验时，常用质量控制图（P421图 14-1）。
强氧化性酸---HClO4
1
2
高沸点203℃；除K+ 、NH4+外，其它盐均溶 于水；
浓热高氯酸具有强的脱水和氧化能力常用于不 锈钢、硫化物的分解和破坏有机物；
3
4
注意安全：浓度低于85%的纯高氯酸十分稳定， 但有强脱水剂（如浓硫酸）或有机物、某些还 原剂等存在一起加热时，就会发生剧烈的爆炸。
荧光定量的原理及过程介绍
1
16
基体影响的校正方法
1. 实验校正法：外标法、内标法、散射内标法、 比例稀释法等；
基体中Al K的低吸收；
1600
E(Si KAl abs. ) : Al
基体中Si K 的高吸收
1100
Al K Si K
600
100% Al2O3 100% SiO2
100
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Hale Waihona Puke 能量(keV)113
Al-Si体系中的基体影响
最大计数率 KCPS
100
1
4
定量分析的基本问题
1. 基体效应 2. 光谱重叠影响 3. 背景影响 4. 定量分析方法 5. 样品制备
1
5
基体效应
基 体: 是指样品中除分析元素外的其他组成元素.在多元体系中不同的分 析元素,具有不同的基体。考虑二次吸收－增强效应，总的基体对 于某个基体元素的吸收与增强影响，基体对于分析线的强度影响不 同与单个基体对于分析线的影响。
Ii =
K I W i 0
( )
A
i
0
() ()
m
sin
m
sin
K i "W
"
i
A
1
2
1
7
基体效应的分类
在光谱分析中基体对测量的分析线的强度影响可分为两 大类： (1) 吸收-增强效应：由于基体的化学组成引起 (2) 物理状态影响:由样品的粒度、均匀性，密度和表
KAPA文库定量试剂盒说明书
KAPA 文库定量试剂盒说明书1. 产品说明：文库精确的定量对于二代测序的结果是非常重要的，过低估计文库的大小，导致clusters 或多重模板太多，数据质量不高，过高估计文库的大小，导致数据读取量少，基因组覆盖率低，所以低估或者高估文库的量都会影响测序效果。
qPCR 是DNA 文库定量的金标准，也是唯一一种能够准确检测出分子数目的方法。
KAPA 文库定量试剂盒包含6个10倍稀释的DNA 标准品，10×Primer Premix ，搭配有KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒，十分准确的确定文库的分子数目。
DNA 标准品片段长度为452bp ，两端包含定量引物的结合位点。
通过标准曲线计算得到定量结果。
基于qPCR 方法的文库定量主要取决于三个因素：① 准确、重现性非常好的标准品的使用；② 用于qPCR 的DNA 聚合酶有较高的扩增效率，且扩增效率均衡；③重复性好。
KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒具有高性能、高通量、实时定量PCR 等特点。
该试剂盒包含一种基因工程酶，耐受SYBR Green Ⅰ染料的抑制作用，KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒是文库定量的理想产品，该试剂盒也适用于扩增高AT 、GC 以及1kb 以上的片段。
2. 应用：KAPA Illumina GA 文库定量试剂盒是用于文库定量的理想产品： ⏹ 定量引物序列：Primer P 1: 5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’ Primer P 2: 5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’ ⏹ 浓度范围广；⏹ 包含高GC 含量的片段； ⏹ 扩增片段长度：50~1000bp 。
3. 操作流程：1) 将1ml Primer Premix 与5ml 的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix （2×）充分混合； 2) 制备好的DNA 文库稀释3个梯度，即：1:2000、1:4000、1:8000； 3) qPCR 反应体系：试剂加入量 引物与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 的混合物 12μl ddH2O4μl 稀释的DNA 文库及标准品（1~6） 4μl 总体积20μl*也适用于10μl 体系，引物与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 的混合物加6μl ，模板加4μl 。
定量分析的一般步骤
定量分析的一般步骤第二章分析试样的采取和预处理方法教学要求：1、掌握定量分析的一般步骤；2、掌握试样采取得一般原则、无机和有机试样的分解方法；3、了解试样的制备和保存方法试样的分析过程，一般包括下列步骤：试样的采取和制备、试样的预处理、干扰组分的掩蔽和分离、定量测定、分析结果的计算和评价。
§2-1 分析试样的采取和制备试样采取得重要性和意义：分析试样的采集: 指从大批物料中采取少量样本作为原始试样，所采试样应具有高度的代表性，采取的试样的组成能代表全部物料的平均组成，否则分析结果再准确也是毫无意义的。
一、采取试样的一般原则1、现场勘察并收集资料；2、代表性；3、采用量符合要求；4、合理保存二、固体试样的采取（一）矿石试样1、采样点的布设（汽车、火车、轮船、矿堆、传送带等）2、湿存水的去除（100-105o C烘干）3、制备制备试样分为破碎，过筛，混匀和缩分四个步骤。
粗碎（过4-6号筛）、缩分、中碎（过20号筛）、缩分、碾磨、缩分、分析试样。
大块矿样先用压碎机破碎成小的颗粒，再进行缩分。
常用的缩分方法为“四分法”，将试样粉碎之后混合均匀，堆成锥形，然后略为压平，通过中心分为四等分把任何相对的两份弃去，其余相对的两份收集在一起混匀，这样试样便缩减了一半，称为缩分一次。
每次缩分后的最低重量也应符合采样公式的要求。
如果缩分后试样的重量大于按计算公式算得的重量较多，则可连续进行缩分直至所剩试样稍大于或等于最低重量为止。
然后再进行粉碎、缩分，最后制成100-300克左右的分析试样，装入瓶中，贴上标签供分析之用。
通常试样的取样量可按下面的经验公式(亦称采样公式)计算：m ＝ Kd a式中：m为采取拭样的最低重量(公斤)；d为试样中最大颗粒的直径(毫米)；K和a为经验常数，可由实验求得，通常K值在0.02-1之间，a 值在1.8—2.5之间。
地质部门规定a值为2，则上式为：m＝Kd2筛号(网目) 20 40 60 80 100 120 200筛孔大小/mm 0.83 0.42 0.25 0.177 0.149 0.125 0.074一般要求通过100-200目筛。
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表1.与KAPA SYBR FAST Universal qPCR Master Mix一起使用的推荐ROX类型
仪器型号
ROX
Applied Biosystems®5700, 7000, 7300, 7700,7900HT, StepOne™, and StepOnePlus™
KAPA Library Quantifcation Kits的所有成分溶液在30次冻融循环中都是稳定的。
确保所有试剂在不使用时在-15ºC至-25ºC避光保存。
Tween®20可以提高移液准确度并减少DNA对塑料管和移液管吸头量流程
1.试剂准备
1.1制备适当体积的DNA稀释缓冲液
10mM Tris-HCl，pH8.0-8.5（25℃）+ 0.05％Tween 20（可选）。
室温或4°C下储存。使用前将缓冲液平衡至室温。
1.2确保KAPA Library Quantifcation Kit的所有组分完全解冻并彻底混合。
•每次移液步骤都要使用新的移液器吸头。标准品和/或样品之间的交叉污染将影响量化的准确性。
•在抽吸过程中，避免将移液器吸头放在试剂表面下太远，因为这可能会导致液体粘附在吸头外部。
•吸取所需体积的溶液后，在打出前检查移液器吸头，确保吸取了正确的体积。
•尽量将液体加入到尽可能靠近管底或孔的位置。
•在液体打出后上下移液2至3次，冲洗移液器吸头L，再进行1/10000倍稀释（通过两次1/10混匀。
1.3中准备的混合物
12.4µL
水(PCR级别)
3.6µL
模板
4.0µL
总体积
20.0 µL
或跳过1.3步骤时，采用如下体系：
qPCR反应混合物
ROX
No ROX
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X)
10.0 µL
10.0 µL
Primer Premix (10X)1
循环数
初始变性
95ºC
5 min
1
变性
95ºC
30 sec
35
退火/延伸/数据采集
60ºC45 sec*熔体曲分析65 – 95°C
*长插入（> 700 bp）增加到90秒。
注意事项
SYBR Green I染料（包含在KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix中）和ROX染料对光敏感。长时间暴露在直射光下会导致荧光信号强度的损失。
NoROX
3.反应体系和反应条件
3.1确定配置混合液的个数
需要一起加入样品孔进行定量的样品类型如下：
•六种DNA标准品（片段为4521-3个）（可选）
•无模板对照1个（NTCs）
混合液总个数为：（6+n+m+1）*3个重复*1.1
3.220µ反应体系如下
1.3如果第一次使用试剂盒，将Primer Premix（10X）（1 mL）加入KAPASYBR®FASTqPCR Master Mix（2X）（5 mL）瓶中。使用涡旋混合器彻底混合。如果您使用的是通用qPCR Master Mix试剂盒，并且仅使用ROX High或ROX Low，则在首次打开试剂盒时，可以使用引物将适当的ROX溶液（50X）（0.2 mL）添加到qPCR Master Mix中。以后使用时，每20μL反应使用12.4μL或每10μL反应使用6.2μL。
必须为每次测定新鲜制备稀释液，并在冰上或4°C下短时间保存。如果稀释的样品在室温下储存，或者在反应器设置，则必须为重复测定准备新的稀释液。
耗材和设备始终使用高质量，低DNA结合的PCR管/板和移液器吸头。
确保根据制造商的建议正确维护和定期校准qPCR仪器和移液器。
3.4将16µL的混合物分配到每个PCR管或孔中。
3水）加入到适当的孔中，记录孔中加样的顺序。
3.6盖上管或密封PCR板，瞬时离心收集试剂至管底，并转移到qPCR仪器。
3.7反应条件设置
……………………..
步骤
温度
时间
准确的液体处理由于qPCR是一种非常灵敏的技术，可以检测到非常低的模板拷贝数，因此结果的可靠性高度依赖于精确的液体处理。
为了确保最高程度的准确性，这可以通过以下方式实现：
•始终确保试剂和样品在使用前完全解冻并彻底混合。
在解冻和混匀后，短暂离心可以去除管壁上的任何液滴。
•如果可能，请避免使用多通道移液器。
•确保分配后尖端中没有残留的液体残留。
1.4记录所有试剂的批号，以及引物（和ROX）加入qPCR Master Mix的日期。 KAPA SYBR FAST qPCR Master Mixes与引物（和ROX）在30次冻融循环中保持稳定，在不使用时放在-20°C下避光保存。混合物可以在4℃下在避光储存≤1周，条件是它们在制备过程中或在随后使用时未被微生物和/或核酸酶污染。
2.0µL
2.0µL
ROX High or Low (50X)(见表1)
0.4 µL
0 µL
水(PCR级别)
3.6 µL
4.0 µL
模板
4.0 µL
4.0 µL
总体积
20.0 µL
20.0 µL
3.3配置除模板以外的其他所有混合物，总体积为16µL*（6+n+m+1）*3个重复*1.1，混合并瞬时离心收集试剂至管底。。
ROXHigh
Applied Biosystems 7500, ViiA™7,QuantStudio™ 12K Flex, AgilentMx3000P™, Mx3005P™, and Mx4000™
ROXLow
Rotor-Gene™, DNA Engine Opticon™,Opticon™ 2, Chromo 4™ Real-TimeDetector, Mastercycler® eprealplex, SmartCycler®, Roche LightCycler® 480, RocheLightCycler Nano, Bio-Rad CFX96, andIllumina Eco™