ViiA7相对定量简易操作指南
QIAamp
本操作手册适用于离心法从140ul 血清、血浆、尿液、细胞培养上清液、无细胞体液、拭子浸液中纯化病毒RNA 。
如需配合QIAcube 核酸纯化工作站实现自动化病毒RNA 纯化，请参阅QIAcbue 操作说明。
如处理更大量的样本（可多至560ul ），按照标准操作流程增加适当比例的裂解液以及载样次数即可。
针对一些病毒含量很低的样本，可参照附录中样本浓缩操作步骤对样本进行浓缩。
注意事项注意事项：：1、 所有步骤所有步骤均均于室温下室温下操作操作(15–25°C)。
2、 样本收集和离心后，血浆（未经处理，或用肝素之外的抗凝剂处理）或血清可在2–8°C 下储存至多6个小时。
如需长期保存，推荐分装后在–20°C 或 –80°C 保存。
冷冻血浆或血清样本不可反复冻融样本不可反复冻融样本不可反复冻融。
反复冻融将会促使蛋白变性沉淀，因而病毒含量降低，导致纯化得到的病毒RNA 的量减少。
并且，反复冻融形成的冷凝蛋白将有可能导致QIAamp 膜堵塞。
冷凝蛋白可通过 6800 x g 下快速离心3 分钟去除，小心吸取上清后立即进行下一步操作。
这一步骤不会影响病毒的含量。
3、 本操作步骤不适用于RNA 和DNA 分离，样本中存在的样本中存在的DNA 和RNA 会被同时纯化出来会被同时纯化出来。
如需完全去除DNA 的影响，推荐使用无细胞体液作为病毒RNA 纯化的起始样本。
含有细胞的样本，例如脑脊液、骨髓、尿液、以及大部分拭子，首先需要过滤，或者1500 x g 离心10分钟以上取上清使用。
如DNA 和RNA 已经一并完成纯化，可将洗脱液经过无RNA 酶的DNA 酶消化处理，接着热处理将DNA 酶灭活。
4、 可以纯化所有大于大于200nt 的RNA 分子分子，小分子RNA 将不能得到高效率的纯化。
本操作手册仅限内部学习使用！如有任何疑问，请联系：胡川（189****3075）准备事项准备事项：：1、 所有样本所有样本平衡至室温平衡至室温2、 Buffer AVE 平衡至室温3、 每个样本每个样本提供提供4个2ml 收集管收集管，，根据不同需要适当自备根据不同需要适当自备无无RNA 酶超净2ml 收集管/1.5ml 离心管4、 按照按照下面的配方准备下面的配方准备AW1 和AW2 BufferBuffer AW1以浓缩液的形式提供。
荧光定量PCR原理与实验流程
林天时 王秋泉 Field Application Scientist 400 820 8982 / 800 820 8982 - 2 - 3 cnmcbsupport@
Life Technologies™ Proprietary | 1
实时荧光定量PCR技术原理
•ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5 6 Proprietary | 54 Life Technologies™ Dye Examples FAM™, SYBR®, SYTO®9 (MeltDoctor™), Fluorescein, SYPRO® Orange VIC®, JOE™, TET™, HEX™ NED™, BODIPY® TMR-X，TAMRA™ ROX™, Texas Red® LIZ™ Alexa Fluor®, Joda-4 Excitation Wave Lenthgh 455~485nm 510~530nm 540~550nm 570~590nm 630~650nm 650~670nm Emission Wave Lenthgh ~520nm ~550nm ~580nm ~620nm ~680nm ~710nm
455~485nm
•7500实时荧光定量PCR系统
Channel 1 2 3 4 5
Life Technologies™ Proprietary | 52
Dye Examples FAM™, SYBR® VIC®, JOE™ NED™, Cy3，TAMRA™ ROX™, Texas Red® CY5 Dye™
定量PCR如何工作?
• PCR反应液加入了 各种类型的荧光标记物
一个PCR循环
7500 2.0相对定量简易操作流程
8. 分析之后的结果，可以利用菜单中的 File>Export 功能，导出 Excel 格式的结果。 若想存储图片结果，可直接在图片上单击鼠标右键，选择 Save as，存成 JPEG 格式的图片。
4. 在“Select relative quantitation setting” 中设置内参基因及对照样本。
相对定量实验简易操作流程
5. 进入 Run Method 界面，设定反应条件及反应体积。
6. 点击
，文件储存成 Experiment Document Single Files （*.eds）格
applied biosystems 7500荧光定量PCR仪 相对定量实验简易操作流程 SDS 2.0
相对定量实验简易操作流程
7500定量PCR仪 相对定量实验简易操作流程
1. 双击桌面图标 ，或从 Start >All Programs > Applied Biosystems > 7500
Software > 7500 V2.0 开启软件。进入主界面后选择 Advanced Setup
相对定量实验简易操作流程量实验简易操作流程
3.1 在
界面中设置基因及样品。利用
添加
新的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher
中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。对于Quencher的选择，如果是
MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；
如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项
相对定量方法实际操作（常用方法）parative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。
2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中P1 P2相同的样品在两页里命名成相同的名称，并定义为unknown分别分析P1和P2页选delta-delta Ct选项依次填入，并定义对照样品公式：Comparative Delta-delta Ct 法的特点、注意事项及实际应用1). Comparative Delta-delta Ct 法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR 扩增即可。
2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。
3). Comparative Delta-delta Ct 法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。
Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R 值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M 值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct 法进行相对完成分析F=2—待检样品看家基因平均Ct 值对照组目的基因平均Ct 值 对照组看家基因平均Ct 值— 待检样品目的基因平均Ct 值 ——定量分析。
反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。
此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。
应用实例：如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。
7500 2.0相对定量
AppliedBiosystems7500荧光定量PCR仪相对定量实验简易操作流程SDS 2.07500定量PCR仪相对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start >All Programs > Applied Biosystems > 7500Software >7500 V2.0开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup（Fig1-1）。
Fig 12.默认进入Setup 下的Experiment Properties 界面2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2确认仪器型号2.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4选择试剂种类2.5确认运行模式3.进入Setup下的Plate Setup 界面，编辑基因（Target）及样本（Sample）：Fig23.1在界面中设置基因及样品（Fig2-1）。
利用“Add New Target”（Fig2-2）添加新的基因，并编辑基因名称及所标记的荧光种类。
例如基因名称为18S，报告基团为FAM，淬灭基团为NFQ-MGB，进行如下图的设定。
也可以通过下拉菜单进行不同的选择：TAMRA作为淬灭基团时选择TAMRA，其他非荧光淬灭基团选择None。
还可以利用其他按钮将之前已添加的基因进行保存或删除。
利用AddNew Sample（Fig2-3）添加新的样本，并编辑样品名称。
3.2在进行样品板的排布。
利用鼠标单击或拖拽以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本（Fig3-1），同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U代表未知样本，N代表阴性对照，Fig3）。
Fig33.3在“Select relative quantitaion settings”中设置内参基因及参照样本（Fig3-3）。
3.4在“Select the dye to use as passive reference”（Fig3-4）中设置参比荧光，如下。
相对定量简易操作流程SDS1.4
applied biosystems 7300/7500/7500 FastReal‐Time PCR System相对定量简易操作指南SDS 1.41. 仪器启动1.1. 打开计算机，待开机完成后再打开 7300/7500/7500 Fast 主机电源；1.2. 待仪器自检完成显示绿灯常亮后，双击计算机屏幕上的软件快 捷图标 开启ABI Prism 7300/7500/7500 Fast SDS软件 ；2. 实验文件设置2.1. 点击进入Create New Document界面：2.2. 在New Document Wizard界面中：在Assay中选择 ddCt (Relative Quantitation) Plate ○1 ，点击Next ○2；2.3. 编辑Detector：2.3.1.选中此次实验所用的Detector ○1，点击Add将Detector加入 Detectors in Document ○2，点击Next○3；2.3.2. 新建Detector：点击New Detector建立新的Detector○1，输入相应信息后点击ok○2，点击Next ○3；也可点击 Create Another，继续添加Detector；Name: 输入基因名称；Reporter Dye: 选择荧光种类；Quencher Dye: MGB 淬灭基团选None；TAMRA淬灭基团选TAMRA；SYBR 选 none；2.3.3. 删除Detector：如果文件中Detector过多需要删除，则在set up 界面中，点击Tools，并在下拉菜单 Detector Manager 中选择不需要的Detector 进行删除；2.4. 命名样品：选定Plate Document 中放样品的孔，选择Detector，在Detector列中Use下勾选○1，同时在Task栏中选择样品的种类○2：Target （目的基因），ENDO（内参基因），点击Finish○3；2.5. 保存文件：点击 File，在下拉菜单中选Save As，输入文件名称并存成SDS Document (*.sds) 的格式；2.6. 设置PCR反应条件：Plate Document 上点击Instrument，进入PCR反应程序设定窗口，可直接更改温度和时间，也可以利用Add Cycle，Add Hold，Add Step或Delete来更改反应步骤，信号收集设置在延伸步骤；使用 SYBR染料法，则点击Add Dissociation Stage添加熔解曲线步骤；3. 结果分析：3.1. 分析查看相对定量数据：运行结束后，单击分析数据；3.2. 在Results选项卡下查看扩增结果：3.3. 相对定量研究分析：点击File，选择New，进入New document Wizard，在Assay中选择ddCt (Relative Quantitation) study○1，点击Next○2；3.3.1. 单击Add plates添加反应板，然后单击Open；在一个RQ研究中最 多可添加10个反应板，单击Finish；如果要同时分析多个plate document，必须确认:a.所有PCR反应板的条件必须一致；b. 正确设置sample name；c. 所有PCR反应板需要有相同的内参基因；3.3.2. 数据分析：选择数据显示方式○1，选择对照样品○2，选择柱状图显示方式○3，进行分析○4；3.4. 导出数据：可点击File，在下拉菜单中选择Export，接着选择Results，导出 .csv数据，用Excel打开。
Voluson730超声诊断仪操作规程
Voluson 730彩色超声诊断仪操作规程、仪器对电源和环境的要求1. 工作环境温度：10-40 °C2. 相对湿度：30%-85%。
3. 电源：100〜120V或220V三线（带接地线）：频率50赫兹。
4. 交流电电源稳压器配置与否取决于当地电源的质量和厂商的要求。
、开机操作程序1. 使用前的准备：1）确保仪器后面的电路开关置于“ OFF”的位置。
2）将仪器连接到电流负荷可达15A、带接地线的电源上。
3）根据使用需要选择探头，将探头连接器插入探头插座，顺时针锁定探头，把探头放在探头架上。
4）连接脚踏开关（必要时）。
5）E CG及生理选件连接（必要时）。
2. 接通电源：1）将主电源开关和控制面板上电源开关开启2）仪器进行初始化和常规自检。
3）监视器出现二维显示。
3. 输入病人资料：1）在键盘上选择“”新建病人键，显示病人资料输入界面2）根据提示输入病人相关资料。
3）再按“”键，资料输入并存储，结束病人资料新建4. 选择探头：1）确认所需探头已经安装好。
2）在键盘上选择" （S）”按键，再从触摸面板界面上选择适当的探头及应用条件。
3）探头可以在多个检查种类/应用中使用。
5. 成像模式及选择：仪器初始化后，二维图像显示在屏幕上。
a ） 按M 、C 、PW 、2D 、3D/4D 、HI 等控制键，可开始不同的显示 模式。
b ） 按相同的控制键，即可退出此模式。
二维成像a ）在控制面板中按压有关控制键和转动有关按钮，可以调节二维图按钮；TGC 调节TGC 滑钮，增益调节可直接旋转 2D 旋钮。
M 型成像a ） M 型图像的获取：按操作面板上的 M 键，用轨迹球将移动二维 图像上M 型取样线定位至所需图像区域，要退出可再按 M 键,b ） 调节M 型显示增益与二维图像的调节方法相同。
多普勒成像a ）脉冲多普勒成像：只需按PW 控制键，再次按PW ,可关闭脉冲 多普勒成像并显示先前的模式。
ViiATM7Dx荧光定量PCR仪操作规程
ViiATM 7 Dx荧光定量PCR仪操作规程Ⅰ. 目的描述ViiATM 7 Dx荧光定量PCR仪的使用和一般维护的标准操作规程。
Ⅱ. 范围适用于ViiATM 7 Dx荧光定量PCR仪的使用和维护。
Ⅲ. 职责由研究所制定程序性文件，所主任负责监督实施。
Ⅳ. 规程1 打开ViiATM 7 Dx仪器：1.1 拨动ViiATM 7 Dx仪器后面的电源开关，然后等待仪器初始化。
（注：当触摸屏显示Main Menu时，ViiATM 7 Dx仪器准备就绪，可以使用。
）1.2 打开ViiATM 7 Dx仪器计算机：1.2.1 按下计算机的电源按钮，然后等待计算机初始化。
1.2.2 当Login屏幕出现时，输入用户名和密码，然后单击OK。
1.2.3 在桌面上，双击ViiATM 7 Dx Sofeware。
（或选择Start→All Programs→Applied Biosystems →ViiATM 7 Dx Instrument→ViiATM 7 Dx Software.）2 关闭ViiATM 7 Dx仪器：不使用时，Applied Biosystems ViiATM 7 Dx实时PCR仪在低功率模式下进行；然而，ViiATM 7 Dx仪器可以完全断开电源，从而部件没有电源。
2.1 关闭ViiATM 7 Dx仪器：2.1.1如果ViiATM 7 Dx仪器触摸屏不是空白，触摸以使仪器置于待机模式。
2.1.2拨动ViiATM 7 Dx仪器后面的电源开关。
2.2 关闭ViiATM 7 Dx仪器计算机：在桌面，选择Start→Shut Down。
3 保存ViiATM 7 Dx仪器：Applied Biosystems ViiATM 7 Dx实时PCR仪可以长时间断开电源和保存。
停用时间长度决定您断开ViiATM 7 Dx仪器电源的方法。
3.1 所需要的材料：MicroAmp Optical 384孔反应板（在运输期间或超过1周的停用期间，空白板能够保护ViiATM 7 Dx仪器的内部部件）。
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Applied Biosystems ViiA™7实时荧光定量PCR仪V1.X相对定量简易操作流程
1.双击桌面图标，，或从Start>All programs>Applied Biosystems>ViiA7Software>ViiA7Software v1.X开启软件。
进入主界面后选择“Experiment Setup”。
2.选择“Setup”下的“Experiment Properties”界面。
2.1输入实验名称(Experiment Name)。
2.2选择Block类型。
2.3选择相对定量实验类型，“Comparative C T”。
2.4选择试剂种类。
Taqman探针法选择“Taqman Reagents”，SYBR染料
法选择“SYBR Green Reagents”。
2.5选择运行模式。
普通试剂选择“Standard”，快速试剂选择“Fast"。
3.选择“Setup”下的“Define”界面设置基因名称(Target)和样品名称(Sample)。
3.1在“Targets”下点击“New”，添加待测基因。
在“Target Name”中编
辑基因名称，“Reporter”和“Quencher”中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于“Quencher”的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团则选择None。
3.2在“Samples”下点击“New”，添加待测样品。
在“Sample Name”中
编辑样品名称。
3.3在“Analysis Settings”下选择合适的“Reference Sample”（对照样
品）和“Endogenous Control”（内参基因）。
4.选择“Setup”下的“Assign”界面编辑样品板。
利用鼠标单选或拖拽以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在“Task”选项中指定该反应孔的类型(U代表未知样本，N代表阴性对照)。
5.选择“Setup”下的“Run Method”界面，编辑运行条件。
6.选择“Run”下的“Amplification Plot”界面，点击“Save As”保存文件，
点击“Start Run”开始运行。
7.实验运行结束后，进入“Analysis”界面，点击右上角的“Analyze”按钮分析数据并查看扩增结果。
7.1设置基线和阈值线：软件默认使用“Auto”功能自动设定基线和阈
值线。
查看阈值线或基线：选择需要查看的基因，将show后的“Threshold”及“Baseline”选择打勾。
扩增曲线图上会出现相应的基线范围和阈值线。
7.2点击”Gene Expression”查看基因表达柱状图。
7.3对于SYBR Green实验，在“Melt Curve Plot”界面中查看熔解曲线。
7.4查看“QC Summary”结果：反应孔存在异常情况时，会出现黄色三
角，数字1代表有一种情况，2代表有两种情况，以此
类推。
详细信息及解决方案可以在“Flag Details”中查看。
8.数据导出：在”Export”界面下导出需要的数据。