相对定量简易操作流程
相对定量实验方法与数据分析
自制荧光定量PCR试剂体系：
常规PCR体系 SYBRGreen或TaqMan探针 备注：Real-Time实验中通常使用热启动酶以降低引物二聚体和非特异性扩增出现的可能性， SYB RGreen对PCR反应有抑制作用，加入量要进行优化
混合试剂
混合：
试剂按照体积大小从大往小的加，将引物/探针（TaqMan方法选用），Real-Time PCR Premix 和PCR water加入到反应管中，cDNA模板最后加。如果是同种引物/探针有多管 的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后 再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染 操作注意事项 1. 2. 3. 4. 样本制备区和加样区要同扩增区分开，避免污染。定量PCR是非常灵敏的实验，微量污 染也会被扩增出，影响结果分析 加样操作要做到非常精确，微量的加样误差也会对实验的重复性造成非常大的影响 PCR预混合液如果需要多次使用，要避光分装保存。避免反复冻融和荧光染料见光降解 每次使用PCR预混合液时要等融化后完全混匀，否则对PCR效率造成很大影响
如果使用TaqMan探针，那么TaqMan探针的结合位置应尽量靠近引物的结合位置， 最好仅相差一个碱基。TaqMan探针的分析方法依赖于Taq酶的5’-列：引物长度一般为18-30base之间，在紧靠引物3’端的5个碱基中不能出现2个或2 个以上的G或C序列，这样会增加非特异性扩增的可能性。上下游引物避免出现连续的互补序列，防 止引物二聚体的形成 扩增产物长度：扩增产物长度最好控制在50-150bp之间，因为扩增较小的片断，PCR效率高。如果 扩增产品不能减少到150bp以内，但可以保证PCR效率接近100%的引物也可以使用。 G/C含量：G/C含量可以在30% ～ 80%之间，不要出现连续4个相连的G. 如果引物序列中的G/C含量 过高会降低PCR效率，也可能会增加非特异性扩增的可能性。在使用SYBRGreen法的相对定量实验时 更应注意引物序列中的G/C含量 Tm值：引物的Tm值是关系到PCR循环设计的参数，引物的Tm一般设计在58～60℃，上下游引物的Tm 不要相差2 ℃以上。探针的Tm值高于引物的Tm值5 ～ 10 ℃左右 探针序列：在探针的5’端结尾碱基不能是G，因为如果G存在，探针即使在水解后的荧光也依然会 被粹灭，影响结果分析
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
定量PCR实验操作流程
五：实验操作
• RNA抽提
• 相分离 • 室温放置上述样品液10min左右后，每 1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子， 剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后 12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出 样品，通过观察可以发现样品分三层，其 ：实验内容
• • • • 细胞RNA抽提 RNA反转录 定量PCR检测 数据分析
四：实验主要仪器和试剂
• 主要实验仪器
• • • • • 冷冻超速离心机 常规PCR仪 酶标仪 电泳系统 CFX96 Real Time PCR System
四：实验主要仪器和试剂
• 主要实验试剂
• RIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异 丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水 • TaKaRa Kits
试剂 SYBR® Premix Ex TaqTM II（2×） PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） 模板（cDNA溶液） 使用量 10 μl 1 μl 1 μl 1 μl 终浓度 1× 0.5 μM*1 0.5 μM*1 *2
dH2O
五：实验操作
• 实验数据分析结果
GAPDH
IL-6
五：实验操作
• 实验数据分析结果
1 04-15-09Time effect of LPS on cytokine mRNA IL-6 no treat 31.49 31.46 31.60 31.46 31.28 31.46 LPS(0.1 ug/mL)_1h 29.47 29.59 29.23 29.59 30.09 29.59 LPS(0.1 ug/mL)_3h 19.74 19.84 19.88 19.84 19.91 19.84 LPS(0.1 ug/mL)_6h 18.58 18.51 18.40 18.51 18.56 18.51 LPS(0.1 ug/mL)_12h 17.36 17.48 17.55 17.48 17.53 17.48 LPS(0.1 ug/mL)_24h 18.71 18.75 18.64 18.75 18.90 18.75 NC 31.85 31.81 31.94 31.81 31.64 31.81 expression in mouse RAW macrophage GAPDH S1 S2 17.10 16.99 14.47 0.00 17.13 16.99 14.47 0.00 16.73 16.99 14.47 0.00 17.20 17.25 12.22 -2.25 17.32 17.25 11.97 -2.50 17.24 17.25 12.83 -1.64 17.23 17.14 2.60 -11.87 17.21 17.14 2.74 -11.73 16.97 17.14 2.77 -11.70 17.44 17.47 1.11 -13.36 17.50 17.47 0.92 -13.55 17.48 17.47 1.09 -13.38 17.18 17.24 0.11 -14.36 17.45 17.24 0.30 -14.17 17.10 17.24 0.29 -14.18 17.07 17.01 1.70 -12.77 17.12 17.01 1.63 -12.84 16.85 17.01 1.88 -12.59 25.83 25.05 24.88 25.05 24.43 25.05 POWER 1.00 1.00 1.00 4.77 5.65 3.11 3746.22 3385.45 3318.35 10543.64 11960.07 10682.73 20975.92 18372.32 18616.37 7000.99 7329.39 6144.93
定量PCR分析的相对定量法
定量PCR分析的相对定量法预先研读科研文献，提出问题。
拟用60Co-γ射线照射HeLa细胞，经0，2，4，8，10Gy不同吸收剂量照射4小时后，研究60Co-γ射线对GRP78 mRNA表达水平的剂量影响关系。
设计拟扩增GRP78以及GAPDH（内参基因）引物序列，稀释合成后引物，验证是否合格能用，储存备用。
上下引物可以考虑预混，储存备用。
准备总RNA提取试剂盒，熟悉实验方法，即熟悉基本步骤与相应所用耗材，准备所用耗材。
知道经该试剂盒方法提取后实际剩下的总RNA体积数。
先培养二瓶细胞，长满后消化后混合，细胞计数，分成6瓶细胞，接种培养至第二天早晨。
编号。
送去钴源室60Co-γ射线照射，无菌操作，放回培养4小时。
按试剂盒程序提取各瓶细胞总RNA。
编号，测定并记录各管总RNA含量与体积数。
当天反转录成cDNA，并编号，测定总cDNA含量与体积数。
预约定量PCR仪器使用时间。
做5X6X2=60份定量PCR反应计划，因有5个剂量组，每一个剂量组做6次平行，2个基因。
考虑额外需要，故预混试剂拟按70份反应计划去准备。
做好96孔板中各孔排布图。
配制除样品cDNA和引物外的预混液，按计划加入96孔板中各孔指定位置内。
再有规律地依次加入规定量的cDNA样品，然后在排布图指定孔位置中加入指定量和指定种类的引物。
核实或做好加样记录。
定量PCR仪器分析开机预热、设定定量PCR仪器基本参数、位置参数和循环参数等；再次混匀96孔板中样品，将样品96孔板放入仪器中，检查后运行PCR仪器。
设计原始资料表格样式，记录各组实际扩增后所得CT值。
根据前面介绍的绝对定量法得到的标准曲线如下图，结合上表查找相应的基因含量数，转录如下表中，然后计算相应的平均数与标准差。
根据均值二次校对值和校对SD用SPSS软件做结果的ANOV A统计分析，检验各组之间的差异有无统计学意义，然后用excel软件作柱状图，并在柱状图上标示出SD变化，以及有无统计显著性差异的标识。
7500 2.0相对定量
AppliedBiosystems7500荧光定量PCR仪相对定量实验简易操作流程SDS 2.07500定量PCR仪相对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start >All Programs > Applied Biosystems > 7500Software >7500 V2.0开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup（Fig1-1）。
Fig 12.默认进入Setup 下的Experiment Properties 界面2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2确认仪器型号2.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4选择试剂种类2.5确认运行模式3.进入Setup下的Plate Setup 界面，编辑基因（Target）及样本（Sample）：Fig23.1在界面中设置基因及样品（Fig2-1）。
利用“Add New Target”（Fig2-2）添加新的基因，并编辑基因名称及所标记的荧光种类。
例如基因名称为18S，报告基团为FAM，淬灭基团为NFQ-MGB，进行如下图的设定。
也可以通过下拉菜单进行不同的选择：TAMRA作为淬灭基团时选择TAMRA，其他非荧光淬灭基团选择None。
还可以利用其他按钮将之前已添加的基因进行保存或删除。
利用AddNew Sample（Fig2-3）添加新的样本，并编辑样品名称。
3.2在进行样品板的排布。
利用鼠标单击或拖拽以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本（Fig3-1），同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U代表未知样本，N代表阴性对照，Fig3）。
Fig33.3在“Select relative quantitaion settings”中设置内参基因及参照样本（Fig3-3）。
3.4在“Select the dye to use as passive reference”（Fig3-4）中设置参比荧光，如下。
相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项
相对荧光定量PCR三种常⽤⽅法、注意事项相对定量⽅法实际操作（三种常⽤⽅法）本⼈⽤的是相对荧光定量PCR法，在分⼦⽔平上⽐较课题中5种新基因的表达差异。
实验进⾏很多次，感受颇深，同时遇到了⼀些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同⾏朋友⼀起探讨和指教。
1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）1).先对样品中的⽬的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否⼀致或接近；将扩增效率优化为⼀致。
2).同⼀样品分别进⾏看家基因和⽬的基因的扩增，分列在两页中公式：P1 P2相同的样品在两页⾥命名成相同的名称，并定义为unknown分别分析P1和P2页选delta-delta Ct选项依次填⼊，并定义对照样品完成分析F=2—待检样品看对照组⽬的基因平均Ct对照组看家—待检样品⽬——Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应⽤1). Comparative Delta-delta Ct法是很常⽤的⼀种相对定量⽅法，其最⼤特点是，当优化的体系已经建⽴后，在每次实验中⽆需再对看家基因和⽬的基因做标准曲线，⽽只需对待测样品分别进⾏PCR扩增即可。
2). 其缺点是，每次实验都默认⽬的基因和看家基因的扩增效率⼀致，⽽并⾮真实扩增情况的反映，这⾥势必存在⼀定的误差。
3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对⽬的基因和看家基因做两组标准曲线。
Rotor-Gene 的软件会⾃动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差⼩于0.1，那么后续实验中就可以⽤Comparative Delta-delta Ct法进⾏相对定量分析。
反之，如果M差值⼤于0.1，就⽆法⽤该⽅法进⾏相对定量分析。
此时的解决⽅法有两种，⼀是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值⼩于0.1，⼆是换⽤其它的相对定量⽅法。
相对定量简易操作流程SDS1.4
applied biosystems 7300/7500/7500 FastReal‐Time PCR System相对定量简易操作指南SDS 1.41. 仪器启动1.1. 打开计算机，待开机完成后再打开 7300/7500/7500 Fast 主机电源；1.2. 待仪器自检完成显示绿灯常亮后，双击计算机屏幕上的软件快 捷图标 开启ABI Prism 7300/7500/7500 Fast SDS软件 ；2. 实验文件设置2.1. 点击进入Create New Document界面：2.2. 在New Document Wizard界面中：在Assay中选择 ddCt (Relative Quantitation) Plate ○1 ，点击Next ○2；2.3. 编辑Detector：2.3.1.选中此次实验所用的Detector ○1，点击Add将Detector加入 Detectors in Document ○2，点击Next○3；2.3.2. 新建Detector：点击New Detector建立新的Detector○1，输入相应信息后点击ok○2，点击Next ○3；也可点击 Create Another，继续添加Detector；Name: 输入基因名称；Reporter Dye: 选择荧光种类；Quencher Dye: MGB 淬灭基团选None；TAMRA淬灭基团选TAMRA；SYBR 选 none；2.3.3. 删除Detector：如果文件中Detector过多需要删除，则在set up 界面中，点击Tools，并在下拉菜单 Detector Manager 中选择不需要的Detector 进行删除；2.4. 命名样品：选定Plate Document 中放样品的孔，选择Detector，在Detector列中Use下勾选○1，同时在Task栏中选择样品的种类○2：Target （目的基因），ENDO（内参基因），点击Finish○3；2.5. 保存文件：点击 File，在下拉菜单中选Save As，输入文件名称并存成SDS Document (*.sds) 的格式；2.6. 设置PCR反应条件：Plate Document 上点击Instrument，进入PCR反应程序设定窗口，可直接更改温度和时间，也可以利用Add Cycle，Add Hold，Add Step或Delete来更改反应步骤，信号收集设置在延伸步骤；使用 SYBR染料法，则点击Add Dissociation Stage添加熔解曲线步骤；3. 结果分析：3.1. 分析查看相对定量数据：运行结束后，单击分析数据；3.2. 在Results选项卡下查看扩增结果：3.3. 相对定量研究分析：点击File，选择New，进入New document Wizard，在Assay中选择ddCt (Relative Quantitation) study○1，点击Next○2；3.3.1. 单击Add plates添加反应板，然后单击Open；在一个RQ研究中最 多可添加10个反应板，单击Finish；如果要同时分析多个plate document，必须确认:a.所有PCR反应板的条件必须一致；b. 正确设置sample name；c. 所有PCR反应板需要有相同的内参基因；3.3.2. 数据分析：选择数据显示方式○1，选择对照样品○2，选择柱状图显示方式○3，进行分析○4；3.4. 导出数据：可点击File，在下拉菜单中选择Export，接着选择Results，导出 .csv数据，用Excel打开。
QS 6 7 相对定量简易操作指南
Applied Biosystems QuantStudio6&7实时荧光定量PCR仪V1.X相对定量简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start>All programs>Applied Biosystems>QuantStudio™Real-Time PCR Software>QuantStudio™Real-Time PCR Software开启软件。
进入主界面后选择“Experiment Setup”。
2.选择“Setup”下的“Experiment Properties”界面。
2.1输入实验名称(Experiment Name)。
2.2选择仪器类型及Block类型。
2.3选择相对定量实验类型，“Comparative C T”。
2.4选择试剂种类。
Taqman探针法选择“Taqman Reagents”，SYBR染料法选择“SYBR Green Reagents”。
2.5选择运行模式。
普通试剂选择“Standard”，快速试剂选择“Fast"。
3.选择“Setup”下的“Define”界面设置基因名称(Target)和样品名称(Sample)。
3.1在“Targets”下点击“New”，添加待测基因。
在“Target Name”中编辑基因名称，“Reporter”和“Quencher”中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于“Quencher”的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团则选择None。
3.2在“Samples”下点击“New”，添加待测样品。
在“Sample Name”中编辑样品名称。
3.3在“Analysis Settings”下选择合适的“Reference Sample”（对照样品）和“Endogenous Control”（内参基因）。
4.选择“Setup”下的“Assign”界面编辑样品板。
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applied biosystems StepOne/StepOnePlus
荧光定量PCR仪
相对定量实验简易操作流程
SDS 2.2
StepOne/StepOnePlus定量PCR仪
相对定量实验简易操作流程
相对定量实验简易操作流程
1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOne
Software> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：
2.1输入实验名称（Experiment Name）
2.2确认仪器型号
2.3
2.3在实验类型中，选择Quantitation-Comparative C T (∆∆C T)
2.4选择试剂种类
2.5确认运行模式
3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：
3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新
的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample Name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选
择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U 代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3 在Select Relative Quantitation Settings 中（参看上图）选择对照样本及内参基因。
4. 在Setup 下的Run Method 界面，设定反应条件。
5. 如果想使用StepOnePlus 仪器上的VeriFlex TM
Block 温度梯度功能，需要先在
界面下，勾选Enable VeriFlex TM Block 选项。
此时Block 即被
分成六个区块。
（此功能仅限StepOnePlus 机型)
然后在Run Method界面中，点击想要调整的温度步骤，
在弹出的界面中，选择并设定每个区块的温度。
两相邻区块的温度差异不能超过5度，即第一与第六区块最多可差异25度。
6.点击，将文件存储成Experiment Document Single files (*.eds) 格式，然
后在Run界面中按下 按钮，反应即开始进行。
7.实验结束后，点击界面右上角的Analyze按钮，软件将会显示实验结果：
7.1在扩增图中（见上图），可通过更改Plot Settings来改变扩增图的显示方式。
如果
想查看阈值线或基线，请将Threshold及Baseline打勾。
7.2查看相对表达量结果时，利用Plot Settings选项，以不同方式显示表达量的结果。
7.3对于SYBR Green法实验，可以在Melt Curve界面中查看熔解曲线。
7.4检查QC Summary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。
黄色三
角中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，以此类推。
详细信息及解决方案可以在Flag Details中看到。
8.分析之后的结果，可以利用菜单中的File>Export功能，导出Excel格式的结果。
若想存
储图片，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Save as，存成JPEG格式的图片。