实验二：丝状真菌生长的测定(精)
丝状真菌的鉴定
鉴定得分
数量及 百分比(%)
使用布鲁克丝状真菌库
v1.0 ≥2.0 ≥1.7 ＜1.7 错误
联合布鲁克和BMU数据库 ≥2.0 ≥1.7 ＜1.7 错误
55 67 37 7
90 104 0 7
(49.5) (60.4) (33.3) (6.3) (81.1) (93.7) (0) (6.3)
111株毛霉：根霉属(48)，毛霉属(41)，横梗霉属(11)，根毛霉属(4)，小 克银汉霉属(5)，共头霉属(2)
染色：乳酸酚棉兰染色
02 丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定
MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌
样品制备 ➢ 直接转移法 ➢ 甲酸提取法—推荐
数据库 ➢ 商业数据库 ➢ 补充数据库
其他影响因素 ➢ 黑色素抑制 ➢ 沙氏葡萄糖液体培养基旋转培养
MALDI-TOF MS-毛霉目真菌的鉴定
• Centraalbureau voor Schimmelcultures (hppt://www.cbs.knaw.nl)
04 常见丝状真菌鉴定
曲霉-直接镜检
曲霉-分生孢子头
分生孢子 瓶梗 顶囊 分生孢子柄
梗基
足细胞
烟曲霉 Aspergillus fumigatus
黄曲霉 Aspergillus flavus
毛霉目真菌-直接镜检
孢囊孢子
柱孢囊
囊轴
囊托
顶囊 孢囊梗
匍匐菌丝
单孢囊
假根
厚壁孢子
粉孢子
毛霉目基本结构
接合孢子 茎孢子
Lichtheimia
横梗霉（Lichtheimia）, 毛霉（Mucor）, 根毛霉（Rhizomucor）和根霉（Rhizopus）的孢子囊特征
第三章 真菌的生长与繁殖
(一) 泡囊学说（Grove，1970年） 1.内容 （1）菌丝顶端1-2μm的顶部区域含有大量的泡囊； （2）泡囊来源于内质网，后转移至高尔基体，在高尔
基体中进行浓缩加工，获得类原生质膜的泡囊膜； （3）泡囊从高尔基体中释放，转移到菌丝顶端，与原
生质膜结合，其内含物释放到膜壁之间用来合成细胞 壁，泡囊膜融入原生质膜，增加膜的面积，导致菌丝 顶端的生长。
直径的一半→两端加棉塞后灭菌→凝固后从一端接种 后→按时测定生长距离，并计算生长率。 二、菌丝干重法 液体培养后，过滤菌丝、洗涤、离心、烘干、称量干 重。仅适用于菌体浓度较高的样品。
第四节 环境的影响与极端耐受性 一、水
液体培养时多数真菌不能形成孢子。 真菌宜在高湿条件下生长，一般以相对湿度表示。 1.相对湿度95-100%生长良好；80-85%时，生长缓慢
“分生孢子”。 ➢ 孢囊梗类型：不分枝、双叉分支、不规则分支→分类
依据。
（三）、分生孢子 最常见的无性孢子，单细 胞或多细胞。 1.分生孢子的发育类型 ➢芽殖型：吹气球方式长 大，与泡囊聚集有关； ➢菌丝型：顶端停止生长， 形成隔膜而断裂。
（1）芽殖型（内生+外生）
①内生芽殖型 ➢从产孢细胞的管孔或孔 道中长出。 ➢产孢细胞只有内壁参与 分生孢子壁合成。 A.瓶梗孢子：孢子从瓶状 产孢细胞上产生； B.孔出孢子：孢子通过产 孢细胞孔道形成。
耐冷：0℃能生长，最适20-25℃。 ① 芽枝霉→冰冻条件下引起冷藏肉类的腐败。 ② 雪霉：如雪腐镰刀菌→侵染植物。
芽 枝 霉
北极雪藻
红雪
③嗜冷菌应用-低温酶（蛋白酶和脂酶最具潜力） • 洗涤工业：耐碱低温脂酶和蛋白酶； • 食品工业：低温凝乳酶用于豆奶凝乳和生产奶
丝状真菌
丝状真菌（霉菌）分离筛选方法霉菌生长在偏酸性有机质丰富的环境中，种类多，形态各异，细胞结构多样。
霉菌是一些丝状真菌统称，同酵母菌一样不是分类学的名词。
一.丝状真菌（霉菌）分离筛选1.培养基：1.1 PDA 培养基： 马铃薯一葡萄糖培养基（同酵母）并添加80%乳酸数滴（5mL/L ）或0.05 %去氧胆酸钠以抑制细菌生长，葡萄糖改为蔗糖。
注：土壤适于马丁或马玲薯一葡萄糖培养基 ，河泥 霉变材料 生物膜适用于查氏 马丁培养基或PDA 培养基1.2 察氏培养基：蔗糖30g/L FeSO 4 0.01g/L NaNO 32.0g/L MgSO 4 0.5g/L KC1 0.5g/L K 2HPO 4 1.0g/L PH6.7-7.01.3马丁培养基： 葡萄糖10g/L 蛋白胨5g/L KH 2PO 41g/L MgSO 40.5g/L 孟加拉红（0.1%）3.3mL 灭菌后使用前加入。
临用时每升培养基加入 1.0%链霉素 3.0mL PH 自然。
1.4特定培养基：橘皮培养青霉 甜酒曲培养根霉。
2.分离纯化：混菌和涂布法将样品梯度稀释（10-4、10-5、10-6），混菌和涂布于平板，25-28℃倒置培养3-7d ， 挑取不同典型单菌落孢子或菌丝进行反复划线纯化。
据菌落质地、颜色是否纯培养物，若有杂菌重复纯化一次。
对于形成固定菌落的（青霉 曲霉等）可用稀释平板混菌法分离纯化，菌落不定型蔓延繁殖的（根霉 毛霉），两菌落及易接触混杂，分离时采取较高稀释度或以培养16-24h 内生长菌丝接种。
根霉菌分离筛选：属于毛霉目，蔓延繁殖，没有一定的菌落形态，易与其他霉菌混生，故分离时采取大稀释度，早移植，可在培养基添加0.1℅去氧胆酸钠，防止蔓延。
可利用形态特征鉴别。
样品：酒药 培养基：葡萄糖豆芽汁培养基（豆芽汁100mL ，酵母膏2g 葡萄糖3g PH 自然。
豆芽汁制备：黄豆100g ，加水1000mL ，煮30-40min ，取汁备用）。
【专家共识】临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求
临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求【专家共识】近年来侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，准确、早期诊断是治疗疾病的关键。
然而，目前我国临床实验室真菌检测能力离临床诊治需求尚有较大差距，亟待改进。
国家卫生计生委办公厅于2016年底发布了《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》（国卫办医函[2016]1281号），要求在2020年以前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设，促进抗菌药物的合理应用，维护人民群众健康。
本共识的制定旨在建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求，推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升，从而提高综合医院真菌感染诊疗能力。
一、术语和定义（一）酵母菌单细胞真菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖，称为酵母菌（yeast）。
临床致病的酵母菌主要包括念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等。
（二）丝状真菌多细胞真菌有菌丝和孢子，菌丝延长分枝，交织成团，称为丝状真菌（filamentous fungi）。
又称霉菌（mold）。
临床重要的丝状真菌包括曲霉菌、毛霉菌、镰刀菌等。
（三）双相型真菌有些真菌可因环境条件（如营养、温度、氧气等）改变，由一种形态转变为另一种形态，称为双相型真菌（dimorphic fungi），如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌、孢子丝菌、马尔尼菲篮状菌等。
这些真菌在体内或在含动物蛋白的培养基上，37 ℃培养时呈酵母相；而在普通培养基，25 ℃培养时呈霉菌相。
二、环境和设施要求真菌实验室环境和设施的设计应确保实验的质量和生物安全。
（一）环境要求真菌实验室应与细菌、病毒等实验室区分，以防发生交叉污染。
其面积以满足工作和安全要求为宜，合理布局。
在建设实验室或开展实验活动之前，应进行生物危害评估。
（二）基本设施设置防飞虫纱窗和门禁，有充足的照明、应急灯、通风、供水、供电、紧急疏散标识及信息系统，工作区设有洗手池、应急淋浴和洗眼装置；门外有生物安全级别标识[1]。
配置生物安全柜和不同温度培养箱（至少包括25~30 ℃以及35~37 ℃）。
丝状真菌生长的测定
菌体干重法：液体培养真菌的生长期完成后，过滤菌丝、洗涤、离心、烘
干、称量干重。这种测定法比较直接而可靠，但仅适用于菌体浓度较高的样品， 而且要求样品中不含有菌体以外的其它干物质。 菌体湿重法：也可以采用测定菌丝湿重法，把烘干步骤省去。但无论测定 干重或湿重，大都用于工业发酵过程的检测。 真菌的生长还可用间接的方法测定，如全氮量和核糖核酸的分析，一般干 的菌丝体含氮量是4.5-8.5%，核糖核酸是2.0-4.0%。另外，还可以分析培养基 中糖的消耗量、氧的吸收量等作为测定生长量的指标。这些方法大都是工业生 产中所采用的方法。
（三）直线生长速率的测定 这一方法使用并不广泛。它是在“Ｕ”形培养管中进行的。培养管长40厘
米，内径约1.3厘米，在两端5厘米处弯成45°角，如图所示。
在培养管中加入适量的溶化的琼脂培养基，达到培养管直径的一半，两端加 棉塞后灭菌。凝固后从一端接种，然后按时测定生长距离，并计算生验内容：菌丝顶端延长生长的测定 1．配制 PDA培养基，高压灭菌备用 2．制备PDA培养基平板，在平板中心点接黑根霉，于28℃培养15h左右。 3．用显微镜的镜台测微尺来校对目镜测微尺。镜台测微尺100格共长1mm，每
格为10μm，标定目镜测微尺上每小格表示多少μm。
4．将黑根霉平板放置于显微镜台上，在菌落边缘选择单根菌丝边缘，在低倍镜 下聚焦。 5．将目镜测微尺与菌丝平行，并选择菌丝开始出现侧枝的位置与目镜测微尺上
细胞质的泡囊起源于高尔基体，高尔基体、核、内质网一起存在于亚顶端部位。
1970年，Grove等人提出了菌丝顶端生长的泡囊假说：
二、菌丝顶端生长的机制 泡囊作用的三重性： 1. 运输细胞壁溶解酶去破坏原来壁 组成之间的键;
2. 运输新的壁物质，并在壁合成酶
丝状真菌的快速鉴定及药敏试验
丝状真菌的快速鉴定及药敏试验彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【摘要】Objective To evaluate the application of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology in the identification of filamentous fungi,and analyze the susceptibility of filamentous fungi to commonly used antibiotics.Methods A total of 100 strains of filamentous fungi were collected and identified rapidly by MALDI-TOF MS.The obtained results were compared with those from microscopic examination.The susceptibility of filamentous fungi was detected by the Etest method.Results Among 100 strains of filamentous fungi identified by MALDI-TOF MS,61 reached to the specieslevel(score≥2.000),36 to the genus level(score between 1.700 and1.999),and 3 failed to be identified (score ＜ 1.700).There was inconsistent results for one strain of filamentous fungi between MALDI-TOF MS and microscopic examination.The MIC90 of amphotericin B against Epidermophytonfloccosum was 0.19 μg/mL,while that against Aspergillus flavus wa s above 32 μg/mL.The MIC90 of itraconazole against Trichophyton tonsurans,Microsporum canis and Epidermophytonfloccosum were all below 0.38 μg/mL,while that against Aspergillus niger was above 32 μg/mL.The MIC90 of fluconazol were above 256 μg/mL for most of strains.The MIC90 of voriconazole and caspofungin against Aspergillus fumigatus,Aspergillus flavus,Aspergillusniger,Trichophyton rubrum,Trichophyton tonsurans and Microsporumcanis were ≤0.38 μg/mL and ≤ 1 μg/mL,respectively.Conclusion The MALDI-TOF MS technology may be used to identify the filamentous fungi isolated from clinical specimens quickly,accurately and high-throughput.Voriconazole and caspofungin have effective anti-filamentous fungi activity.%目的评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在丝状真菌鉴定中的作用,分析常用抗菌药物对丝状真菌的药敏试验结果.方法收集100株丝状真菌,采用MALDI-TOF MS进行快速鉴定,并与显微镜检查结果进行比对;用E-test法进行丝状真菌药敏试验.结果 MALDI-TOF MS对100株丝状真菌鉴定达到种鉴定水平的有61株(得分≥2.000),达到属鉴定水平的有36株(1.700～1.999),未能鉴定的有3株(＜1.700);与镜检结果不一致的有1株.两性霉素B对絮状表皮癣菌的90％最低抑菌浓度(MIC90)为0.19 μg/mL,而对黄曲霉的MIC90＞32 μg/mL.伊曲康唑对断发毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的MIC90均＜0.38 μg/mL,而对黑曲霉的MIC90＞32 μg/mL.氟康唑对大部分受试菌株的MIC90均＞256μg/mL.伏立康唑和卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、红色毛癣菌、断发毛癣菌和犬小孢子菌的MIC90分别≤0.38μg/mL和≤1μg/mL.结论 MALDI-TOF MS技术可快速、准确、高通量检测临床分离的丝状真菌.伏立康唑和卡泊芬净对丝状真菌具有较好的抗菌活性.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2017(035)007【总页数】5页(P486-490)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;丝状真菌;真菌药敏试验【作者】彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【作者单位】苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003【正文语种】中文【中图分类】R446.5近年来，由于器官移植、免疫抑制剂使用、侵入性治疗、恶性肿瘤、HIV感染等患者逐年增多，以及广谱抗菌药物的广泛应用，丝状真菌的感染比例呈上升趋势。
真菌学实验报告
真菌学实验报告一.实验目的：1.1了解真菌形态的基本特征。
1.2掌握丝状真菌制片方法。
1.3掌握内生真菌的分离方法1.4掌握真菌的鉴定方法。
二.前言：真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。
真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。
当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。
真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。
因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。
植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。
研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。
三.材料与方法：3.1.1材料：在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。
3.1.2.药品与试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。
孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。
消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。
双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇(β- Mercaptoethanol)，石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。
丝状真菌形态观察
实验四 结 束
�
The major classes of fungi
Oomycetes(卵菌纲) Zygomycetes(接合菌纲) Ascomycetes(子囊菌) Basidiomycetes(担子菌纲) Deuteromycetes(半知菌纲)
观察霉菌的形态) 实验程序(观察霉菌的形态)
青霉, 青霉,黑曲霉观察
Mucor racemosus Geotrichum candidum Aspergillus niger Penicillium notatum Rhizopus oryzae
Several types of sexual spores
Oospores(卵孢子) Zygospores(接合孢子) Ascospores(子囊孢子) Basidiospores(担孢子)
实
验
四
丝状真菌形态的观察
丝状真菌形态的观察
目的要求 实验材料 实验程序 思考题
目的要求
学习观察丝状真菌形态的基本方法 加深理解丝状真菌的形态特征
实验材料
青霉, 丝状真菌培养物 :青霉,黑曲霉 水浸片法:根霉, 水浸片法:根霉,白地霉 显微镜,载玻片,接种环,解剖针,酒精灯, 显微镜,载玻片,接种环,解剖针,酒精灯, 镊子等. 镊子等. 乳酚油,碘液,酒精,蒸馏水等. 乳酚油,碘液,酒精,蒸馏水等.
囊轴columella 囊轴 囊托apophysis 囊托 孢子囊sporangium 孢子囊
匍匐菌丝stolon 匍匐菌丝 假根rhizoid 假根
孢子囊 sporangium
囊轴columella 囊轴
囊托apophysis 囊托 孢囊孢子sporangiospores 孢囊孢子
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实验二 丝状真菌生长的测定
一、概念
丝 状 真 菌 （ filamentous fungi ） ， 俗 称 霉 菌 （ mould, mold ），通常指那些菌丝体较发达又不产生大型肉质子实体 结构的真菌。
一、测定方法 1）菌丝生长的测定：
① 马铃薯（PDA）培养基倒平板，冷却（无菌操作）。
配方：葡萄糖 20克 ，琼脂 20克，削皮马铃薯 200克煮汁 定容至1000ml，pH自然，115℃灭菌30分钟； ② 待测菌株点接于培养基平板中心，倒置28℃度培养； ③ 待菌落长出后，将平板算每一格的长度。在菌落边缘选 择单根菌丝的顶端在低倍镜下聚焦，然后将目镜测微尺与菌丝平 行，并选择菌丝开始出现侧枝的部位与目镜测微尺上的一条线重 合，这个点即为“参照点”。每隔一定的时间测量一次菌丝生长 的长度，观察数次后，根据时间和延长生长的长度划一条生长曲 线，并求出生长速度（毫米/小时）。
2）直接生长速度的测定： ① PDA培养基倾注入“U形”培养管中，注入 培养基的量，达到培养管直径的一半，另一端用塞 子塞好；
② 凝固后从一端接种，置28℃培养箱中培养；
③ 每日测定生长距离，并计算生长率。
三、结果记录： 1）每个方法作一张表格，记录每次不同时间丝
状真菌生长情况。
2）比较两种方法的优缺点。