革兰氏染色实验
革兰氏染色法实验报告共5篇
革兰氏染色法实验报告篇一革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，可用于鉴定细菌的类型和形态。
以下是一份革兰氏染色法的实验报告范例，包含实验目的、实验原理、实验步骤、实验结果和结论等部分。
实验目的： 1.了解革兰氏染色法的原理和步骤； 2.掌握细菌的革兰氏染色方法； 3.观察细菌在革兰氏染色中的反应，并进行鉴定。
实验原理：革兰氏染色法是根据细菌细胞壁的特性而设计的一种染色方法。
细菌细胞在染色过程中会根据细胞壁的结构不同，分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁，含有较多的革兰氏染色阳性物质（如染色时用的紫檀碱），因此在染色后会呈现紫色。
革兰氏阴性菌细胞壁较薄，不含有革兰氏染色阳性物质，染色时使用的碘酒（革兰氏碘化酒）能使它产生复合革兰氏染色阳性物质（碘靛紫），再用酒精脱色，再用洋红着色，使其产生颜色变化，最终呈现红色。
实验步骤： 1.准备好菌液：选取需检测的菌株，用无菌盘收集少量菌落，用少量生理盐水悬浮，制备菌液。
2.片玻璃片：在清洁无菌玻璃片上滴上一滴菌液。
3.烘干：将玻璃片架起，自然风干。
4.固定：将玻璃片的细菌涂片在火焰上迅速烘烤，使其牢固地附着在玻璃片上。
5.染色：将烘烤后的玻璃片放入紫檀液中，染色1分钟。
6.脱色：用酒精脱色10-30秒。
7.洗净：用自来水清洗片上的超染色剂。
8.再染：将片浸入碘靛紫溶液中，染色1-2分钟。
9.脱色：用酒精脱色10-30秒。
10.洗净：用自来水清洗片上的超染色剂。
11.观察：利用显微镜观察和比较细菌的形态和染色情况。
12.记录：记录细菌的形态、颜色等观察结果。
实验结果：通过观察细菌的形态和颜色，我们可以得出以下结论：•革兰氏阳性菌在染色后呈现紫色；•革兰氏阴性菌在染色后呈现红色。
结论：革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，通过染色反应可以初步鉴定细菌的类型。
本次实验中，我们成功地使用革兰氏染色法对细菌进行了染色和鉴定，观察到了不同细菌的染色结果，并且将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。
革兰氏染色法实验报告
革兰氏染色法实验报告实验目的，通过革兰氏染色法对细菌进行染色，观察细菌的形态特征，以及判断细菌的结构类型。
实验材料与方法：材料，大肠杆菌培养液、革兰氏染色试剂（紫晶染液、碘液、酒精、碳酸钠）、玻璃片、显微镜、移液管、灭菌架等。
方法：1. 取一块玻璃片，在玻璃片上滴上一滴大肠杆菌培养液。
2. 用火杀菌的移液管，取少许紫晶染液滴在大肠杆菌液上，静置1分钟。
3. 用移液管滴上碘液，静置1分钟。
4. 用移液管滴上酒精，以使玻璃片上的颜色变浅，然后用水冲洗。
5. 用移液管滴上碳酸钠，静置1分钟，然后用水冲洗。
6. 用吸水纸吸干水分，放在灭菌架上晾干。
7. 取一块盖玻片，将其放在玻璃片上，用手指轻轻按压，使两者紧密结合。
实验结果与分析：观察革兰氏染色后的大肠杆菌，发现其为革兰氏阴性菌，因为在显微镜下观察到的细菌呈现红色。
革兰氏阴性菌的特点是细胞壁含有脂多糖，不易被革兰染色的染料染色，因此在染色后呈现红色。
实验结论：通过本次实验，我们成功地利用革兰氏染色法对大肠杆菌进行了染色，并观察到了细菌的形态特征。
同时，根据染色结果，我们判断出大肠杆菌为革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法是一种简单而有效的细菌染色方法，通过本次实验的实践操作，我们对革兰氏染色法有了更深入的理解，为今后的实验操作提供了宝贵的经验。
实验注意事项：1. 实验操作过程中要注意使用消毒的器具，避免细菌污染。
2. 在染色过程中，要严格按照步骤进行操作，避免染色失败。
3. 在观察细菌形态特征时，要调节显微镜，以获得清晰的观察效果。
总结：本次实验通过革兰氏染色法对大肠杆菌进行了染色，成功观察到了细菌的形态特征，并判断出了细菌的结构类型。
革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，通过本次实验的实践操作，我们对其有了更深入的理解，为今后的实验操作提供了宝贵的经验。
希望通过本次实验，能够增进对细菌染色方法的理解，为今后的学习和研究工作打下良好的基础。
革兰氏染色的实验报告（共9篇）
革兰氏染色的实验报告(共9篇)革兰氏染色实验报告革兰氏染色法的原理及其练习摘要：革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，所以学习微生物学，进行革兰氏染色实验是很重要的。
为保证染色结果的正确性，采用规范的的染色操作方法是十分必要。
本实验主要对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）进行革兰氏染色，观察它们的染色特征，辨别是革兰氏阴性还是阳性，从而掌握其染色方法。
染色方法与过程很清晰，但实验结果中金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach）多组呈现假阴性。
本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理，但要想做出很好的染色得多加练习。
本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。
关键词：革兰氏染色大肠杆菌(E.coli) 金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach) 枯草杆菌(B.subtilis)引言革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法，它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。
革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。
经过一定的染色过程后，革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高，脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。
革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，蓝色被洗脱，复染后变为红色。
革兰氏染色原理很简单，染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细菌，涂片不宜过厚，严格控制脱色时间。
大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性细菌，金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach)与枯草杆菌(B.subtilis)都是革兰氏阳性细菌，染色后在显微镜下容易区别。
同时它们的形态各异，可以根据具体颜色和形态差异来判断染色是否成功。
本实验还涉及到高倍油镜的使用。
细菌革兰氏染色的实验报告
细菌革兰氏染色的实验报告细菌革兰氏染色的实验报告一、引言细菌革兰氏染色是一种常用的实验方法，用于区分细菌的结构和特性。
通过革兰氏染色，可以将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类，从而在临床诊断和疾病治疗中起到重要的作用。
本次实验旨在探究细菌革兰氏染色的原理和操作方法，并通过观察染色结果，进一步了解细菌的特性。
二、实验材料与方法1. 实验材料：- 细菌培养物：选择两种细菌菌株，一种为革兰氏阳性细菌，另一种为革兰氏阴性细菌。
- 革兰氏染色试剂：包括紫晶染液、碘液、脱色剂和红色染色液。
- 玻璃片和显微镜片：用于制作细菌涂片和观察染色结果。
2. 实验方法：- 步骤一：取两种不同的细菌培养物，分别在玻璃片上制作细菌涂片。
- 步骤二：将制作好的细菌涂片分别加入紫晶染液，静置5分钟。
- 步骤三：用蒸馏水冲洗玻璃片，使其清洁。
- 步骤四：加入碘液，静置1分钟。
- 步骤五：用脱色剂冲洗玻璃片，直到无色流出。
- 步骤六：加入红色染色液，静置1分钟。
- 步骤七：用蒸馏水冲洗玻璃片，使其清洁。
- 步骤八：将玻璃片放在显微镜片上，用显微镜观察细菌染色结果。
三、实验结果与讨论通过观察细菌染色结果，可以清晰地看到两种细菌的差异。
革兰氏阳性细菌在染色后呈紫色或蓝色，而革兰氏阴性细菌则呈红色。
这是因为细菌细胞壁的结构不同导致的。
革兰氏阳性细菌具有较厚的层状细胞壁，由多层的胞外多糖和蛋白质组成。
在染色过程中，细菌细胞壁的多糖会与紫晶染液结合，形成复合物。
而碘液的加入会使复合物更加稳定，不易被脱色剂去除。
因此，革兰氏阳性细菌在染色后仍保持紫色或蓝色。
相反，革兰氏阴性细菌细胞壁较薄，主要由一个薄层的胞外脂多糖组成。
在染色过程中，细菌细胞壁的脂多糖无法与紫晶染液结合，因此无法形成复合物。
碘液的加入也无法稳定脂多糖，使其被脱色剂去除。
因此，革兰氏阴性细菌在染色后会被红色染色液覆盖，呈现红色。
细菌革兰氏染色的结果可以帮助我们快速区分细菌的类型，从而指导临床的诊断和治疗。
细菌革兰氏染色实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法。
2. 学会使用油镜观察细菌的形态。
3. 了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理革兰氏染色是细菌学中一种重要的染色方法，主要用于区分细菌的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在细胞壁结构上存在显著差异，导致它们在革兰氏染色过程中表现出不同的染色特性。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量高，交联度大，乙醇脱色处理后，细胞壁收缩，但结晶紫-碘复合物仍然被留在细胞内，使细菌呈紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，肽聚糖层薄且交联度差，乙醇脱色处理后，细胞壁溶解，结晶紫-碘复合物被脱出，再经碱性品红染液复染，使细菌呈红色。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏染色液（草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、碱性品红染液）、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、酒精灯等。
2. 仪器：显微镜、油镜、移液器、移液吸头等。
四、实验步骤1. 涂片：取一环蒸馏水于载玻片中央，用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成约1cm²的薄菌膜。
2. 固定：将涂片在空气中干燥，手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上快速通过3次，以让菌膜更加牢固地贴在玻片上，待冷却后滴加染料。
3. 初染：手持玻片一端，滴加草酸铵结晶紫染液染色2min后，倾去染液。
4. 媒染：向涂片滴加碘液，媒染1min后，倾去碘液。
5. 脱色：向涂片滴加95%乙醇，脱色30s，观察菌体颜色变化，直至出现红色。
6. 复染：向涂片滴加碱性品红染液，复染1min后，倾去染液。
7. 洗涤：用蒸馏水冲洗涂片。
8. 染色观察：用油镜观察菌体形态和染色特性。
五、实验结果与分析1. 枯草芽孢杆菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。
2. 金黄色葡萄球菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。
六、实验讨论革兰氏染色是一种简单、快速、有效的细菌分类方法。
革兰染色实验报告
革兰染色实验报告革兰染色实验报告一、实验目的：通过革兰染色法，观察并区分细菌的革兰氏阳性和革兰氏阴性的特征，进一步了解革兰氏染色的原理和过程。
二、实验原理：革兰染色是病原微生物鉴定和分类的重要方法之一，可用于判断微生物是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌。
原理是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁组成不同，前者细胞壁中含有厚壁的murein层和一些多糖类物质，后者细胞壁中只含有薄壁的murein层，革兰染色的原理是根据这一差别来进行染色。
染色步骤如下：1.准备菌液：取一株具有不完全结构的细菌菌落，悬浮在蒸馏水中制备菌液。
2.烘干菌液：从菌液中取一滴，滴在清洁的玻片上，用火焰烘烤几秒钟，待菌液干燥。
3.革兰素溶液：制备革兰染色工作溶液，将1%的革兰素溶液稀释到10倍。
4.染色过程：将烘干的菌液滴在玻片上，滴上革兰素溶液，静置1分钟后用蒸馏水洗净，然后在玻片上滴上碱性紫试剂，再用蒸馏水冲洗，最后在玻片上滴上碘试剂，再用蒸馏水冲洗，使背景显色。
将玻片在浓度逐渐增大的乙酸酒精中漂洗，直到玻片漂洗后无色即可，然后用蒸馏水冲洗。
最后，在玻片上滴上红染试剂，染色10秒钟后用蒸馏水冲洗干净，晾干后，镜下观察。
三、实验步骤：1.准备菌液：取一株细菌菌液，用蒸馏水制备悬浮液。
2.烘干菌液：取一滴菌液滴在玻片上，用火焰烘干几秒钟，使菌液干燥。
3.加染料：滴上革兰素溶液，静置1分钟后用蒸馏水冲洗。
4.加试剂：滴上碱性紫试剂，再用蒸馏水冲洗；滴上碘试剂，再用蒸馏水冲洗。
5.漂洗：用浓度逐渐增大的乙酸酒精漂洗，直到玻片漂洗后无色。
6.染色：滴上红染试剂，染色10秒钟后用蒸馏水冲洗干净，晾干后，放在显微镜下观察。
四、实验结果和分析：在显微镜下观察，发现革兰染色后，革兰氏阳性菌呈紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌呈红色。
革兰氏阳性菌的细胞壁厚，染色较蓝色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁薄，染色较红色。
这是由于革兰染色方法中经过上述的染色步骤，革兰氏阳性菌能够保留革兰蓝的颜色，而革兰氏阴性菌会被红染剂覆盖掩盖住。
用革兰氏染色实验报告
用革兰氏染色实验报告引言革兰氏染色是微生物学中常用的染色方法之一，它是由丹麦微生物学家克里斯蒂安·格拉姆（Christian Gram）于1884年首次提出的。
革兰氏染色方法能够将细菌区分为革兰阳性和革兰阴性两类，对细菌的鉴定和分类具有重要意义。
本实验旨在通过革兰氏染色方法，观察和鉴定所需细菌的性质。
材料与方法实验材料- 细菌培养物- 牛津线- 凝聚试剂（碘酒）- 乙醇- 结晶紫染液- 茚-甲醛染液- 脱色液（95%乙醇）- 尼格拉试剂实验步骤1. 取适量的细菌培养物，均匀涂布在玻片上。
2. 用针刺取一根牛津线，先蘸取结晶紫染液，在涂片上涂抹20-30秒。
3. 用蒸馏水轻轻冲洗，使多余的染色剂流走。
4. 再用乙醇逐滴滴在涂片上，持续滴加直到滴下的乙醇不再显色。
5. 再次用蒸馏水洗涤。
6. 接下来用茚-甲醛染液涂抹涂片，静置5分钟。
7. 用蒸馏水轻轻冲洗。
8. 用脱色液（95%乙醇）滴在涂片上，直到涂片待比较清晰为止。
9. 再用蒸馏水洗涤。
10. 用尼格拉试剂滴于涂片上，观察显色情况。
结果与分析通过以上步骤我们得到了染色后的涂片。
观察涂片后的颜色变化，我们可以将细菌划分为革兰阳性和革兰阴性两类。
- 革兰阳性细菌：这类细菌在革兰氏染色后，呈现紫色或紫蓝色。
这是由于细菌细胞壁较厚，染色剂容易进入细胞内部，形成结晶紫复合物，并且乙醇处理后不易脱去。
常见的革兰阳性细菌有葡萄球菌、链球菌等。
- 革兰阴性细菌：这类细菌在革兰氏染色后，呈现粉红色。
这是由于细菌细胞壁较薄，染色剂容易逸出，不能在乙醇处理中保持染色。
常见的革兰阴性细菌有大肠杆菌、沙门菌等。
实验中遇到的问题及解决方法在实验过程中，我们遇到了染色不均匀、显色较弱等问题。
我们通过以下方法解决了这些问题：1. 涂布时要均匀：将细菌涂布在玻片上时，要注意用均匀的手法涂布，尽量避免涂布过厚或者过稀。
2. 染色时间要掌握好：染色液在涂片上的时间过长，会导致染色剂过多，出现混淆；染色液在涂片上的时间过短，会导致染色剂进入细胞内不充分，显色较弱。
革兰氏染色实验报告
革兰氏染色实验报告革兰氏染色实验报告一、实验目的1.了解细菌的形态特征和分辨颜色能力；2.认识细菌的清洁度；3.熟悉革兰氏染色的步骤和操作。
二、实验器材和药物器材：革兰氏染色盒、光学显微镜、玻片、神经力酸具、胶质高锰酸钾、白醛、甲基红色、结晶紫、酒精、1%碘酒等。
药物：静脉注射用葡萄糖液。
三、实验步骤1.取一块较大的细菌营养琼脂涂片，用抹菌棒取少量细菌涂于玻璃片上；2.用夹片夹住玻璃片，将菌涂片放置在酒精灯上烘烤，直至滴出菌液时，颜色变浅；3.将磁力架上的杯子放满脱脂后的酒精，将菌涂片放入酒精中浸泡2分钟；4.拿出菌涂片，将其放在流动自来水下冲洗5-10秒；5.将菌涂片放入盛有静脉注射用葡萄糖液的杯子中浸泡2分钟；6.取出菌涂片，在菌涂片上均匀涂抹胶质高锰酸钾后，放置5分钟；7.将菌涂片在流动自来水下冲洗5-10秒，然后在结晶紫中浸泡30秒；8.将菌涂片在流动自来水下冲洗5-10秒，然后在甲基红色溶液中浸泡30秒；9.将菌涂片在流动自来水下冲洗5-10秒，用纸巾吸干水分；10.将菌涂片放在显微镜片上，加入一滴油，然后放入显微镜下观察。
四、实验结果经过革兰氏染色后，观察到细菌在显微镜下呈现两种不同的染色方式：革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。
五、实验讨论1.通过观察细菌的形态特征和染色结果，可以判断细菌的革兰氏阴性或阳性。
2.实验中使用的静脉注射用葡萄糖液是为了在染色过程中保持细菌活性。
如果细菌死亡，则无法进行革兰氏染色，染色结果可能不准确。
3.在实验过程中，要保持实验环境的整洁和无菌，避免细菌的污染。
六、实验心得通过本次实验，我学会了革兰氏染色的操作步骤和技巧。
革兰氏染色是一种重要的细菌染色方法，能够区分出革兰氏阴性和阳性菌，并观察到其形态特征。
实验中我注意保持实验环境的清洁和无菌，以确保实验结果的准确性。
通过显微镜观察细菌染色结果，我对细菌的形态有了更深入的认识。
这次实验对我今后的学习和研究有着重要的意义。
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革兰氏染色实验
革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。
(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明)。
未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
阳性紫色，阴性红色
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌：
革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌。
革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆
菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎
双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克
雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢
疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜
血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍
乱弧菌、阴沟肠杆菌等。
革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中
占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，产生“新德里金
属酶”（NDM-1）的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌（主要是大肠
杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌）。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。
大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。
细胞形态和结构
细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。
原生质体位于细胞壁内，包括细胞膜（细胞质膜）、细胞质、核质和内含物。
另外细胞还含有有些特殊结构，主要有荚膜、芽孢、鞭毛和菌毛等4种。
1.细胞壁
革兰氏染色的机理主要是抓住了革兰氏阳性细菌与阴性细菌在细胞壁的结构与组成上的不同，具体比较见下表：
进一步的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖构成，细胞表面整体带负电的部分原因就是因为磷壁酸带负电。
同时，磷壁酸赋予了革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原。
总的说来，细胞壁结构的差异导致了染料吸收的差异，也导致了很多生理特性的不同。
2.非细胞壁结构
在非细胞壁结构中，革兰氏阳性细菌和阴性细菌主要的区别在于是否有芽孢和鞭毛与性菌毛的不同上。
芽孢是某些细菌菌体发育过程中的一个阶段，在一定的环境条件下由于细胞质和核质的浓缩凝集形成的一种特殊结构。
革兰氏阴性细菌中没有会形成芽孢的菌种，而部分革兰氏阳性细菌可以。
另外，在鞭毛和性菌毛方面两者也有不同。
鞭毛和性菌毛都是附属物。
某些细菌表面伸出的细长、波曲的附属物称为鞭毛。
革兰氏阳性细菌的鞭毛上基本着生两个环，革兰氏阴性细菌则基本着生四个环。
性菌毛只见于革兰氏阴性菌，参与细胞间称作接合作用的交配过程。
生理特性
以下是关于革兰氏阳性细菌和阴性细菌在生理特性方面的比较。
两者的不同从本质上来说，还是主要是由细胞结构的不同所决定的。
步骤：
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
（1）制片。
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。
（2）初染。
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。
（3）媒染。
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
（4）脱色。
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
因而脱色时间一般为20-30s。
（5）复染。
用番红液复染约2min，水洗。
（6）镜检。
干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
原理：
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。
革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；
而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色
[1]。
染色的差异主要是阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。
①革兰氏阳性细菌的细胞壁
G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层，多达50层，占细胞壁成分的40%～95%，它同细胞膜的外层紧密相连（图2-9）。
有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也称胞壁质（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。
由于磷壁酸带负电荷，它在细胞表面能调节阳离子浓度。
磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素（autolysins）酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。
如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。
除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。
②革兰氏阴性细菌的细胞壁
G—细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄（15～20nm）而结构较复杂，分外膜（outer membrane）和肽聚糖层（2～3nm）（图2-10）。
在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙（periplasmic space）。
外膜 G—细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同细胞质膜相同之处也是双层类脂，但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。
O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脱氧已糖。
由于糖的种类不同，使各种G—细胞具有不同特性的LPS。
核心多糖（core polysaccharide）的主要组分是酮脱氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。
外膜中还含有几种蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。
有些蛋白具有通孔作用（porin），调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常称为内毒素（endotoxins）。
肽聚糖层 G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄，在大肠杆菌和其它细菌中仅有单层。
肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。
壁膜间隙 G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙，一层薄的肽聚糖处于其间，肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽，肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。
大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12～15nm，呈胶胨态。
其间含有三类蛋白质：水解酶，催化食物的初步降解；结合蛋白，启动物质转运过程；化学受体（chemoreceptors），在趋化性中起作用的蛋白。
染色结果：
革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。