革兰氏染色实验

革兰氏染色实验

革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明)。

未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

阳性紫色，阴性红色

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌：

革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌。

革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆

菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎

双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克

雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢

疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜

血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍

乱弧菌、阴沟肠杆菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中

占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，产生“新德里金

属酶”（NDM-1）的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌（主要是大肠

杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌）。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。

细胞形态和结构

细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。原生质体位于细胞壁内，包括细胞膜（细胞质膜）、细胞质、核质和内含物。另外细胞还含有有些特殊结构，主要有荚膜、芽孢、鞭毛和菌毛等4种。

1.细胞壁

革兰氏染色的机理主要是抓住了革兰氏阳性细菌与阴性细菌在细胞壁的结构与组成上的不同，具体比较见下表：

进一步的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖构成，细胞表面整体带负电的部分原因就是因为磷壁酸带负电。同时，磷壁酸赋予了革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原。

总的说来，细胞壁结构的差异导致了染料吸收的差异，也导致了很多生理特性的不同。

2.非细胞壁结构

在非细胞壁结构中，革兰氏阳性细菌和阴性细菌主要的区别在于是否有芽孢和鞭毛与性菌毛的不同上。

芽孢是某些细菌菌体发育过程中的一个阶段，在一定的环境条件下由于细胞质和核质的浓缩凝集形成的一种特殊结构。革兰氏阴性细菌中没有会形成芽孢的菌种，而部分革兰氏阳性细菌可以。

另外，在鞭毛和性菌毛方面两者也有不同。鞭毛和性菌毛都是附属物。某些细菌表面伸出的细长、波曲的附属物称为鞭毛。革兰氏阳性细菌的鞭毛上基本着生两个环，革兰氏阴性细菌则基本着生四个环。性菌毛只见于革兰氏阴性菌，参与细胞间称作接合作用的交配过程。

生理特性

以下是关于革兰氏阳性细菌和阴性细菌在生理特性方面的比较。两者的不同从本质上来说，还是主要是由细胞结构的不同所决定的。

步骤：

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

（1）制片。

取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。

（2）初染。

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。

（3）媒染。

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

（4）脱色。

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般为20-30s。

（5）复染。

用番红液复染约2min，水洗。

（6）镜检。

干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

原理：

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。

革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；

而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色

[1]。

染色的差异主要是阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。

①革兰氏阳性细菌的细胞壁

G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层，多达50层，占细胞壁成分的40%～95%，它同细胞膜的外层紧密相连（图2-9）。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也称胞壁质（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷，它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素（autolysins）酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。