基因工程知识点全
基因工程知识点总结
基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
高中生物选修三基因工程知识点总结
高中生物选修三基因工程知识点总结
高中生物选修三(基因工程)知识点总结如下:
1. 基因工程的基本步骤:
- 分离基因:从目标DNA序列中分离特定的基因。
- 转录:将分离得到的基因转录成RNA。
- 修饰:对转录后的基因进行修饰,使其更具表达效果。
- 克隆:用适当的载体将修饰过的基因导入目标细胞中。
- 表达:使目标细胞中导入的基因表达。
2. 基因工程的主要方法:
- 重组DNA技术:包括文库制备、扩增和筛选。
- 外源DNA片段导入技术:包括限制性内切酶消化、连接、转化、融合等。
- 自组织培养技术:包括离心、培养基选择、细胞培养等。
- 基因编辑技术:包括CRISPR/Cas9、CRISPR-Cas13a等。
3. 基因工程的应用:
- 细胞治疗:通过基因工程手段治疗一些遗传性疾病。
- 农业育种:通过基因工程技术改良作物品质和产量。
- 生物恐怖袭击防御:通过基因工程技术检测和防御生物恐怖袭击。
- 环境污染治理:通过基因工程技术处理污染物。
4. 基因工程的限制:
- 伦理和道德问题:基因工程技术可能会带来未知的伦理和道德
问题。
- 技术成本:基因工程技术相对其他技术更为复杂,成本较高。
- 技术安全:基因工程技术的安全性需要持续进行研究和维护。
5. 基因工程的安全性问题:
- 基因突变:基因工程过程中可能会引发基因突变,导致不良后果。
- 质量控制:基因工程技术的产品需要进行质量控制,以确保其质量和稳定性。
高考生物《基因工程知识点》总汇
高考生物《基因工程知识点》总汇1、基因工程的先导是？艾弗里等人的工作证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体2、不同生物的基因为什么可以连接在一起？因为所有生物的DNA基本结构是相同的3、真核生物的基因为什么可以在原核生物体内表达？（或者原核生物的基因为什么可以在真核生物体内表达？）所有生物共用一套密码子4、基因工程育种的原理是什么？具有什么优点？原理：基因重组优点：打破了生殖隔离，定向改造生物的性状5、与DNA有关的酶的比较6、特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割7、限制酶不切割自身DNA的原因是什么？原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
8、DNA连接酶可以连接什么样的末端？①同一种限制酶切割形成的相同的黏性末端②两种不同限制酶切割后形成的相同黏性末端③任意的两个平末端9、如何防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”？可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。
10、载体需具备的条件及其作用11、基因工程的基本操作步骤是哪四步?目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定12、目的基因的获取方法有哪些？三种方法都需要模板吗？①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③通过化学方法人工合成前两种需要模板，从基因文库中寻找目的基因时需要用DNA探针利用DNA分子杂交的方法找到目的基因；化学方法人工合成不需要模板，只要知道核苷酸序列就行，这是一个纯粹的化学反应13、CDNA文库和基因组文库的区别？cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。
以细胞的全部mRNA 逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体成为cDNA文库。
cDNA文库只包含表达的基因，并且逆转录得来的基因缺乏内含子和启动子、终止子等调控序列基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆得到的所有重组体内的基因组DNA片段的集合，它包含了该生物的所有基因。
基因工程主要知识点整理
第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。
构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。
亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。
PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。
但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。
第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。
限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。
甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。
并且能够保证自身的DNA不被降解。
使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。
如：HindIII限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。
II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。
其限制反应与甲基化反应是分开的反应。
不需要ATP的参与。
限制酶识别的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。
回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。
但他们的切割位点有可能不同。
分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。
基因工程知识点
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
基因工程知识点
名词说明1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与适合的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因和蛋白质的活性表达，使转基因生物取得新的遗传性状的操作。
2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。
3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。
4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性结尾。
5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。
连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一路的3’羟基结尾与5’端磷酸基团结尾之间通过形成磷酸二酯键，使两结尾连接的一种核酸酶。
7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。
8.多克隆位点：是包括多种同一个限制性酶切点的一段很短的9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基尽管宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们能够融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。
10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。
11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳固遗传的一类核酸分子12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,即可查明该样品中是不是存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。
那个标记的核酸分子称为探针(probe)，能够是DNA，也能够是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，因此可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。
基因工程知识点总结
基因工程知识点总结基因工程，这个在现代生物学中熠熠生辉的领域，正以惊人的速度改变着我们的生活和对生命的认知。
它就像是一把神奇的钥匙，开启了无数未知的大门，为解决人类面临的诸多问题带来了前所未有的希望和可能。
一、基因工程的定义与基本原理基因工程，简单来说，就是按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行切割、拼接和重组，然后导入另一种生物的细胞内，使之稳定遗传并表达出相应产物的技术。
其基本原理基于三个重要的步骤：首先是获取目的基因，这就像是在茫茫基因海洋中找到我们想要的那一颗珍珠；其次是构建基因表达载体，相当于给这颗珍珠打造一个合适的盒子，使其能够安全、有效地传递；最后是将重组 DNA 分子导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
二、获取目的基因的方法1、从基因文库中获取基因文库就像是一个巨大的基因仓库，里面存储着各种各样的基因。
我们可以根据已知的信息，从这个文库中筛选出我们需要的目的基因。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 技术就像是一个基因的复印机，能够以极少量的基因片段为模板，快速大量地复制出我们想要的基因。
3、人工合成法如果已知目的基因的核苷酸序列，或者其氨基酸序列，我们可以通过化学方法直接人工合成目的基因。
三、基因表达载体的构建基因表达载体是基因工程的核心部分，它就像是一辆专门运输基因的列车，需要具备多个关键组件。
1、启动子启动子是基因表达的“开关”，它能够控制基因在何时何地开始表达。
2、终止子终止子则是基因表达的“刹车”，告诉基因在何处停止表达。
3、标记基因标记基因就像是一个个小标签，帮助我们筛选出成功导入目的基因的受体细胞。
4、目的基因这是我们最终想要表达的基因片段。
四、将目的基因导入受体细胞1、导入植物细胞（1）农杆菌转化法农杆菌就像是一个天然的基因运输工具，能够将其携带的基因转移到植物细胞中。
（2）基因枪法通过高速的微粒将目的基因直接打入植物细胞。
（3）花粉管通道法利用花粉管通道将目的基因导入植物的受精卵中。
高中生物 基因工程知识点
专题1 基因工程（一）基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。
原理是基因重组，操作水平是分子水平。
优点：打破物种界限；定向地改造生物的遗传性状。
（二）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）主要从原核生物中分离纯化出来。
（2）功能：使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（3）特点具有专一（特异）性。
（4）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶（1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；而T4-DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
（2）与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的脱氧核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体（1）载体具备的条件：①能够稳定保存并复制；②有一至多个限制酶酶切位点③含有标记基因，便于筛选。
④对受体细胞无害。
（2）最常用的载体是质粒，化学本质是小型环状DNA分子。
（3）其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒（三）基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以指具有调控作用的因子。
2. 基因文库包括基因组文库和cDNA文库。
二者的区别：3.人工合成目的基因的两个条件：基因比较小；核苷酸序列已知。
4.PCR技术扩增目的基因（1）PCR是多聚酶链式反应的缩写，原理DNA双链复制。
（2）过程：第一步变性：加热至90～95℃，DNA解链，不需要解旋酶；第二步复性：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链。
变性和复性利用了DNA的热变性原理；第三步延伸：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
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第一章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。
从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。
1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？?具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
?具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
?具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
?具有合适的筛选标记。
?分子量小，拷贝数多。
?具有安全性。
2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有 1.克隆质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.探针质粒 6.表达质粒3. 质粒的构建（1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源 DNA 片段的装载量。
一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。
（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
4. 什么是人工染色体载体？将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体？人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。
6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。
?1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点?引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性?灭活某些与裂解周期有关基因。
?使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现象的发生。
?加装选择标记，便于重组体的检测7.M13单链噬菌体DNA载体?过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。
?引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列（lacZ’）的乳糖操纵子片段（lac）、组氨酸操纵子片段（his）以及抗生素抗性基因等。
?将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色。
?（4）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列，使得重组DNA 分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。
8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）是一类能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶。
?识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列（靶序列）。
?识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。
?切割位点的规范性：双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。
同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶。
同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶（Isocandamers）：识别位点不同，但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。
9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。
甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一种酶的切口?甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。
?甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。
10.DNA连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基（-OH），另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基（-P）的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接DNA分子的作用。
②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。
③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick），而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。
⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD＋或ATP）11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？DNA聚合酶作用的特点：?要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA。
?接受模板指导。
?需要有引物（3’羟基）的存在。
?不能起始合成新的DNA链。
?催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端。
?催化DNA的合成方向是5’→3’。
Klenow酶的基本性质：?大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶。
分子量为76kDa。
?Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。
Klenow酶的基本用途：?修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端，使之成为平头末端。
?以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记。
?用于催化 cDNA 第二链的合成。
?用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列。
12.T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：?有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性。
?在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切。
?在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。
?在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：?温度（最主要的因素）离子浓度?ATP的浓度( 10M - 1M )?连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）?反应时间（通常连接过夜）?插入片段和载体片段的摩尔比?DNA末端性质?DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接？1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解，两种DNA分子均含有相同的粘性末端，因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA 分子2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下，能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子，但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。
3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平，或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用？1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作，以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷，则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接。
16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？?给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾。
?DNA片段3’末端的同位素标记。
17. 2、细菌转化的步骤：感受态的形成。
感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。
感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等。
转化因子的结合。
受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。
转化因子的吸收。
双链 DNA 分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中。
整合复合物前体的形成。
进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。
转化因子单链DNA的整合。
供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA 的同源区域，形成异源杂合双链 DNA结构。
18.Ca2+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。
但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。
19.PEG介导细菌的原生质体转化PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合。
20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。
P52 接合转化，入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。