基因工程知识点

基因工程各章知识点

第一章绪论

1．基因工程的首例操作实验

三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定

三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用

基因工程的诞生：

72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子

73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性

S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌

2．基因工程的基本概念

基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。

供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。

3．基因工程的基本操作过程

a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。

b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。

c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。

d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。

e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

第二章载体

1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定

PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。

如果在pBR322质粒的Tet r基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tet r基因编码序列的连续性，使tet r 失去活性，产生出Amp r Tet s表型的重组pBR322质粒，转化入Amp s Tet s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Amp r菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Amp r基因内位点插入外源DNA片断，则反之。

PUC18作载体的克隆外源基因的原理：

在pBR322的基础上，在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

典型的pUC系列的质粒载体包括如下4个组成部分：a、pBR322的复制起始点。b、氨苄青霉素抗性基因但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。c、大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因。d、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。

2．理想载体的必备条件

（1）、较小的分子量和较高的拷贝数。

（2）、应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的单一酶切位点。

（3）、具两种以上的选择标记基因。

（4）、重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。

3．穿梭载体和a-互补

A 穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。

常见的穿梭质粒有大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体。

B lacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal 能力的。但如果在M15突变体的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段（α肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称做α互补。

第三章核酸操作的基本技术

1．碱解法提取质粒DNA的原理？提取DNA时常用试剂的作用

原理

碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

常用试剂的作用

溶菌酶：溶解菌体细胞壁的β-1，4糖苷键，即具溶菌作用。

葡萄糖：增加溶液粘度，防止DNA受机械切力作用而降解

EDTA：金属离子螯合剂，抑制脱氧核糖核酸酶（Dnase)对DNA的降解作用

SDS：阴离子表面活性剂，①可破坏细胞膜，使DNA释放出来，②结合蛋白质，使蛋白质沉淀下来③抑制脱氧核糖核酸酶（RNase)的活性。

酚、氯仿：蛋白质变性剂。使蛋白质失水变性，；离心后与水相（含DNA）分离。

异戊醇：降低分子表面张力，可减少气泡的产生；有助于分相。

无水乙醇：DNA的沉淀剂。夺取DNA周围的水分，使DNA失水而易于聚合。

NaOH：核酸在pH=5~9的溶液中稳定，pH>12或pH<3时会引起氢键断裂。

KAc：KAc-HAc，pH=4.8缓冲液，变性的质粒DNA在此溶液中发生复性。

2．RNA分离的关键因素。（RNA酶是一种蛋白质，所以提取时利用氯仿抽提可以很好去除，得到高质量的RNA。）

RNA分离的关键因素是尽量减少RNA酶（RNase）的污染，因此在RNA制备过程中，必须注意控制RNase 酶的活性，并设法抑制其活性。

造成RNase酶污染源有：所用的器皿、所用的溶液、实验人员的手及飞沫。

玻璃器皿：烘箱中（180 ℃)烘烤8h以上。

塑料器皿：0.1%DEPC（diethylpyrocarbonate，二乙基焦碳酸盐)浸泡或用氯仿洗涤。

配置的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上，然后高压灭菌。

全部实验过程均需戴手套操作, 并经常更换。

RNA电泳槽常用去污剂洗涤，0.1%DEPC处理。

提取中出现RNA

降解原因：操作过程中温度太高、操作时有RNA酶的污染或RNase抑制剂量不足等都有可能使RNA降解。

解决方法：做好使用器皿的RNase去除工作；在整个操作过程中最好在低温(4℃)或是冰上进行；操作者自始至终戴手套。

3．电泳法和紫外分光光度法都能检测DNA的浓度和纯度，哪种方法更好。

A、紫外光度法

原理：核酸中含有嘌呤和嘧啶环，在256~265nm处显示出特征吸收峰，在230 nm 处吸收最小。DNA或RNA分子在260 nm处有特异吸收峰，吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。

方法：首先用TE或ddH2O稀释待测DNA样品；用TE或ddH2O为空白对照，在260 nm及280 nm处调节紫外分光光度计读数为0；加入DNA稀释液与上述两波长处读取OD 值；A260值为1时相当于50ug/mL 的dsDNA，40ug/mL的ssDNA或RNA；通过计算公式计算浓度及纯度。

双链DNA（ds DNA）浓度（μg /ml）=50×OD260×稀释倍数

单链DNA 或RNA （ssDNA ssRNA ）浓度（μg /ml）=40×OD260×稀释倍数

DNA 纯度可通过OD260/ OD280来衡量：纯的DNA的OD260/OD280为1.8~2.0；OD260/ OD280＞2.0为RNA污染，＜1.8为蛋白质污染；OD260/OD280＜0.9时适当稀释样品，可再进行一次抽提；OD260/OD280＞2时则RNA过高，要除去RNA。

B、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

在生理条件下，核酸分子是多聚阴离子当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。

原理：在琼脂糖凝胶中加入EB，当与DNA混合时EB可插入到DNA分子中形成荧光络合物。而EB在

紫外光照射下能发射荧光，荧光的强度与DNA的含量成正比。便可十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的存在、强度和谱带的位置。在适当的染色条件下，荧光的强度同DNA数量成正比，据此，人们可以估计DNA的浓度。不同大小的DNA片段在凝胶中的迁移速度不同，据此，科研工作者们便能判断DNA 的分子质量，其有无降解；同时，通过同已知分子质量的标准DNA片段之间的比较，还可测定出随迁移的DNA片段的分子质量。

4．为什么核酸保存在TE溶液（Tris-HCl 和EDTA）中比较稳定

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa=7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3（PO4）2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-Hcl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH /Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCL系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

第四章限制性内切酶

1．寄主的限制与修饰的作用

R/M中的限制作用（restriction)是指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA（外源DNA）导致噬菌体寄主幅度受到限制的现象。

限制酶来完成R/M中的修饰作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化作用得以甲基化，使DNA获得修饰，从而避免遭自身限制酶的破坏。

寄主的限制与修饰有两个方面的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解。

细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。

3．同裂酶同尾酶完全消化不完全消化星号活性

同裂酶（isoschizomers）：来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶。

同尾酶（isocaudamer）：来源不同，识别序列也各不相同，但能产生出相同的粘性末端的RE。由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接，在基因克隆中很有用。

完全酶切消化（complete disestion )：如果一种RE对某个DNA分子的所有识别位点均实现了完全的切割，称为完全酶切消化。

限制性内切酶的不完全消化（partial digestion)：RE对DNA分子的消化不完全，即未能在所有分子的所

有识别位点进行完全的切割，可获得分子量大小有所增加的限制片段产物。

星号活性：非最适条件（酶量大、甘油高、低离子强度，高pH等）常使酶发生不正确切割（切割特异性序列相似的序列）。

4．影响酶切的因素

（1）、DNA纯度：DNA制剂中，Pro.酚，氯仿，酒精，EDTA，高盐浓度等，影响RE的活性。

提高酶切效率方法：增加RE用量；扩大反应体积以使潜在的抑制因素相应稀释；延长酶切时间。（2）、DNA甲基化程度：甲基化作用会强烈影响酶活性；基因工程中用的菌株为丧失了甲基化酶的；不同位点之间的甲基化程度是不相同的且与DNA 来源的细胞类型有密切关系。

（3）、酶切反映温度：

（4）、DNA分子结构：超螺旋比线性DNA需酶量大; DNA 的边侧序列也有影响。

（5）、RE的缓冲液：Mg2+。Tris-HCl：使pH处于最佳数值范围内。保护酶稳定性的物质β-巯基乙醇、（DDT)、（BSA)。

第五章DNA的连接

1．连接酶的作用及范围

作用：连接酶是一种能够催化DNA上裂口两侧（相邻）核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口重新连接起来的酶。在DNA复制、修复以及重组过程中起重要作用。

范围：可连接切口(nick），但不可连接缺口(gap)。可连接双链DNA 分子的一部分，但不可连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA 分子。

DNA连接酶的种类：

1、T4噬菌体DNA连接酶：T4噬菌体DNA连接酶(又称T4DNA连接酶)分子质量为68Ku，需要ATP作为辅助因子，最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。

范围T4噬菌体DNA连接酶可以连接：（1）两个带有互补黏性末端的双链DNA分子。（2）两个带有平头末端的双链DNA分子。（3）一条链带有切口的双链DNA分子。（4）RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连接。

2、大肠杆菌DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶分子质量为75Ku，需要NAD+作辅助因子。

范围大肠杆菌DNA连接酶可连接：（1）两个带有互补黏性末端的双链DNA分子。（2）一条链带有切口的双链DNA分子。

2．影响连接的因素

A、影响因素：反应温度、离子浓度、DNA末端的结构、DNA末端的相对浓度、DNA片段的浓度和相对分子量等对连接效率都有影响。

连接反应速度完全由互相匹配的DNA末端浓度所决定。

在连接反应体系中，一般可形成两种不同构型的DNA分子：①线性分子；②环状分子。在基因克隆操作技术中，DNA分子的构型直接影响转化过程。

对于两个以上的DNA分子的连接，不仅要考虑反应体系中DNA末端的总浓度，而且还要考虑载体与

插入片段的末端浓度的比例。

原则上，应该保证一个DNA分子的未端具有较高的几率与另一个DNA分子连接，以减少自连，从而达到重组的目的DNA分子间的连接。

B、提高连接效率的方法：

a 适宜的温度：为粘性末端的Tm与DNA连接酶最适温度的折衷。

b [插入片段]>[载体片段]10-20倍。

c适当加大酶的用量，但单位含酶量低时，随着用量的加大，甘油含量也提高了，反而影响连接效率。

d用碱性磷酸酶处理载体，使5’-P变为5’-OH，减少载体自连，提高重组分子形成比率。

3．平齐末端的连接方法

A、直接用T4连接酶连接

B、同聚物加尾法：不需模板链的存在，末端脱氧核苷酸转移酶可将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH上。故在反应物中存在一种脱氧核苷酸的条件下，便构成由同一种类型核苷酸组成的多聚核苷酸尾巴，当两种DNA分子带有可互补配对的poly尾巴时，能彼此连接起来，此种连接方式称为同聚物加尾（一般加10-40个碱基就足够了）。

应用（1）、酶切后形成的平齐末端。（2）、机械切割大分子DNA产生平齐末端。（3）、RNA：cDNA具有平齐末端。

缺点：无法在尾巴处（原位）再进行切割。

C、衔接物连接法：所谓衔接物（linker)是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成具有一个或数个限制酶识别位点的平齐末端的双链寡聚核苷酸片段。

将衔接物的5’末端和待克隆的DNA的5’末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4连接酶的作用将两者连接起来。接着用适当的RE消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者产生出了的互补的粘性末端，则可用连接酶将DNA分子和载体分子按常规的粘性末端连接法将二者连接起来。

优点：兼具同聚加尾法和粘性末端法各自的优点；可以根据实验需要设计不同RE识别位点的衔接物，从而大提高平齐末端DNA片段的连接效率；可实现外源片段定向克隆。

缺点：基因内部有相同酶位点时，酶切会把该基因切断，从而给后续的亚克隆和其他操作带来麻烦。D、接头连接法

第六章转化及重组体的鉴定

1．感受态

感受态：凡是能吸收游离DNA片段的细菌称为感受态细菌或者说处于感受态；正常生长条件下的一个或多个不同生长时期都处于高度感受态的细菌；经过特殊处理才表现感受态；对于转化表现强烈抑制的细菌。2．在DNA水平上检测转化体的方法有哪些；RNA水平的检测方法。答案不确定

DNA水平上

质粒DNA的提取和限制性酶切分析；质粒DNA与分子杂交。观察是否有表型变化的重组体。联合运用直接和间接的手段进行快速而准确的鉴定。

重组体的筛选：直接选择法：抗药性标记选择，插入失活法；标志补救如α互补；分子杂交法原位杂交；

Southern印迹。非直接选择法：免疫学方法如免疫化学方法酶免检测法。

第七章目的基因的获得

1．什么是cNA？如何通过构建cNA文库和基因组文库获得目的基因

cDNA（complementary DNA)：是指与mRNA 互补的DNA，是由mRNA通过反转录酶进行反转录而成的。

cDNA文库的构建

基本过程：通过一系列的酶促作用，使总poly(A)mRNA制剂转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内。如此便构成了包含产所有基因编码的cDNA基因文库（cDNA library)。

反转录酶复制载体受体菌

具体步骤

第一步：分离总RNA，然后从总RNA中分离出mRNA部分，约占细胞总RNA的1％-2％。

第二步：以mRNA为模板，经过逆转录合成第一条cDNA。

第三步：将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。

第四步：将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体上。

第五步：将重组分子转入大肠杆菌主细胞中进行增殖。

应用λ噬菌体构建基因组文库：

1、基本步骤：从供体基因组DNA产生适当大小的DNA片段；在体外将这些DNA片段同适当的λ噬菌体连接成重组分子；转化到大肠杆菌的受体细胞中去；从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的片段。

2. 供体DNA制备：

（1）、机械切割产生合适大小的外源DNA片段。

（2）、RE的部分消化产生合适大小的外源DNA片段。

从基因组DNA文库获取目的基因：组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶基因片段克隆载体

受体菌

2．PCR的原理；引物；简并引物；RT-PCR;

PCR的原理：实质为体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链后，DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种dNTPs，以与模板互补的核苷酸为引物，合成新生的DNA互补链。理想拷贝数=2n，（n：循环次数）；实际拷贝数=(1+x)n，（X：平均效率,约为0.85，n：循环次数）

9

引物定义：是（两条）人工合成的与模板DNA互补的核苷酸链

长度:一般为15-30bp，且与单链DNA模板互补，短的6-12bp,长的35bp。

两引物与模板结合位点之间的距离决定了扩增区段的长度，1kb为理想的扩增跨度，2kb左右为有效扩增跨度。

简并引物：简并引物是由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差

异。

RT-PCR:先将RNA转录成cDNA，接着以cDNA为模板进行PCR扩增。这一技术称为反转录PCR （reverse transcription PCR RT-PCR)。

3．设计简单的引物；如何通过PCR获得目的基因

给出DNA序列，写出引物

第八章凝胶电泳与分子杂交

1．如何通过琼脂糖凝胶检测DNA（电泳的原理及影响因素）

电泳原理

在生理条件下，核酸分子是多聚阴离子当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。

在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。

凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。

琼脂糖凝胶电泳（agrose gel electrophisis）

（1）支持介质：琼脂糖是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。（2）分辨能力：琼脂糖凝胶基质的孔径大小可以通过调整琼脂糖的浓度来改变。其分辨力为为0.2~50kb范围之间的DNA片段；凝胶浓度越大，介质孔径越小，分辨能力越强。

影响DNA电泳的因素

DNA分子大小、DNA分子构型、凝胶浓度、电场强度、EB、电泳缓冲液

2．Southern杂交；缺口平移法制备探针

Southern杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E. Southern于1975年首先设计出来的，故又叫做Southern DNA印迹转移技术。

缺口平移法制备探针：首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去带有5’磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。

3．什么是Northern杂交和western杂交

Northern杂交：将变性（用甲醛、乙二醇，防止RNA形成二级结构）琼脂糖胶电泳分离的RNA 或mRNA，转移吸印到特殊（叠氮化的或其它化学修饰的）的活性滤膜或滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起，与标记的探针RNA或DNA杂交，然后放射自显影以分析RNA （大小、数量）的方法，这种方法同萨瑟恩的DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺塞恩RNA

吸印杂交技术（Northern blotting）。

western杂交:将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素125Ⅰ标记的特定蛋白质之抗体进行反应，以检测蛋白质的杂交技术，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（ Western blotting）。

第九章测序

Sanger测序的原理（2分题）

利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定核苷酸顺序的方法。也称为引物合成法或酶催引物合成法。

原理：DNA聚合酶能利用单链DNA为模板，离体合成出其互补链，当反应液中存在2‘，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它可以象2‘-脱氧核苷三磷酸（dNTP）那样直接掺入新合成的DNA链中，但因ddNTP 3’ 端不具-OH基团，所以寡核苷酸链就不能再继续延长了即DNA链合成中止了。

第十章植物基因工程

1．反义核酸Ti质粒GFP

反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。

Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D, 约有200kb左右。具有接合转移特性

GFP（绿色荧光蛋白基因）：这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。

2．Ti质粒的改造

应掌握以下几个原则：a、保留T—DNA的转移功能和vir区。b、除去T—DNA的致瘤性（激素基因）。 c、通过简便手段使外源DNA插入T—DNA ，并可随之整合到植物染色体上。

3．农杆菌转化的原理

农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、茎段等共同培养的一种转化方法。

转化过程：再生体系的建立——转化共培养法——筛选——再生——检测——southern blotting 和PCR检测(田间检测)

4．如何筛选理想的转基因植物

通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，还必须对抗性植株进一步检测。

(1) DNA水平的鉴定

检测内容：是否整合、拷贝数、整合位置。

检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物）

Southern杂交（外源目的基因序列为探针）

(2) 转录水平的鉴定

常用的方法：Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交）RT-PCR 检测

（3）翻译水平的鉴定

为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。主要方法：Western杂交、免疫检测

第十一章外源基因的表达

判断题出2分

基因工程各章复习纲要

第一章绪论

1．基因工程的首例操作实验

2．基因工程的基本概念

3．基因工程的基本操作过程

第二章载体：

1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理

2．理想载体的必备条件

3．穿梭载体和a-互补

第三章

1．碱解法提取质粒DNA的原理？提取DNA 时常用试剂的作用

2．RNA分离的关键因素。（RNA酶是一种蛋白质，所以提取时利用氯仿抽提可以很好去除，得到高质量的RNA。）

3．电泳法和紫外分光光度法都能检测DNA 的浓度和纯度，哪种方法更好。

4．为什么核酸保存在TE溶液（Tris-HCl 和EDTA）中比较稳定

第四章限制性内切酶

1．寄主的限制与修饰的作用

2．RE识别序列的特点

3．同裂酶同尾酶完全消化

不完全消化星号活性

4．影响酶切的因素

第五章DNA的连接

1．连接酶的作用及范围

2．影响连接的因素

3．平齐末端的连接方法

第六章转化及重组体的鉴定

1．感受态2．在DNA水平上检测转化体的方法有哪些；

RNA水平的检测方法

第七章目的基因的获得

1．什么是cDNA？如何通过构建cDNA文库和基因组文库获得目的基因

2．PCR的原理；引物；简并引物；RT-PCR; 3．设计简单的引物；如何通过PCR获得目的基因

第八章凝胶电泳与分子杂交

1．如何通过琼脂糖凝胶检测DNA（电泳的原理及影响因素）

2．Southern杂交；缺口平移法制备探针3．什么是Northern杂交和western杂交

第九章测序

Sanger测序的原理（2分题）

第十章植物基因工程

1．反义核酸Ti质粒GFP

2．Ti质粒的改造

3．农杆菌转化的原理

4．如何筛选理想的转基因植物

第十一章外源基因的表达

判断题出2分题

考题类型

1 名词（20分，每题4分）

2 判断对错（20分，10题）

3 填空（10分，10题）

3 简答题（30分，每题5分）

4 论述题（20分，每题10分）