RhofRho激酶信号通路与轴突导向和再生的研究进展

・综述・Rho/Rho激酶信号通路与轴突导向和再生的研究进展时国兵1综述，朱政鸣2，唐文渊1审校（1.重庆医科大学附属第一医院神经外科400016；2.重庆市急救医疗中心神经外科400014）关键词：Rho；Rho-kinase；轴突生长锥中图分类号：@556.9文献标识码：A文章编号：1671-8348（2006）24-2285-03Rho是小分子量GTPases超家族Rho亚家族成员，是Ras 超家族的哺乳动物基因同系物。

Rho可以通过其下游效应因子Rho激酶（Rock或Rho-kinase）调节细胞肌动蛋白骨架的重组，从而广泛参与细胞迁移、运动、凋亡、基因转录、神经再生等生物学过程。

过去的研究证实，Rho蛋白及其相关的信号分子参与并介导了轴突的再生、延伸、纤维的投射等生物学过程。

本文就Rho蛋白及其下游调节因子Rho激酶在轴突导向和再生中的作用做一综述。

!"Rho/Rho激酶信号通路的基本概念Rho/Rho激酶信号通路的关键分子包括：Rho、Rho激酶和肌球蛋白磷酸酶。

Rho作为Ras家族的哺乳动物基因同系物，是小分子量GTPases超家族Rho亚家族成员，Rho亚家族分子量约为20~30kd，由氨基酸序列高度同源的3种异构体组成：RhoA、RhoB、RhoC。

Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的Rho-GDP形式两种状态存在于细胞质中［1，2］。

Rho 受多种细胞因子的调控［1，3］，鸟苷酸交换因子（GEFs）为Rho 激活剂；GTP酶激活蛋白（GAPs）和GDP解离抑制因子（GDIs）为Rho灭活剂。

GEFs能够使Rho释放GDP并结合GTP；GAPs 能激活Rho分子本身的GTP酶活性，使GTP水解为GDP；GDIs 可抑制Rho-GDP和Rho-GTP两种状态间的转换。

在上述分子的调节作用下使Rho完成两种状态之间的转换，以实现其信号转导过程中的“分子开关”作用。

Rho激酶（ROCK）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，以两种同源性极高的异构体存在：ROCK!/ROCK"和ROCK#/ROCK$，是目前研究最为清楚的Rho下游效应分子［4］。

Rho激酶的分子结构包括氨基端的催化结构域、中间结合Rho的!卷曲螺旋结构域和羧基端的催化结构域以及Cys/ His区。

Rho能与Rho激酶的!卷曲螺旋结构域结合，激活Rho激酶［5］。

Rho激酶被激活后能够使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活，使得肌球蛋白磷酸化程度增高［4~6］，从而影响肌动-球蛋白系统而导致轴突生长锥的塌陷，抑制轴突生长［4，7，8］。

肌球蛋白磷酸酶（myosin phosphatase，MP）是Rho激酶活化后的底物，由3个亚单位组成，包括110~130ku肌球蛋白结合亚单位（myosin-binding sub-unit，MBS）、37ku催化亚单位（PP-1c）和20ku功能不明的小亚单位。

活化的Rho激酶能使MP的MBS亚单位肽链第697位苏氨酸发生磷酸化修饰而失活，失活的MP不能将肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）去磷酸化，从而增加胞浆内MLC磷酸化水平，肌动肌球蛋白交联增加，促使肌动蛋白微丝骨架的聚合［1，2，4］。

#"Rho/Rho激酶信号通路与轴突导向轴突生长的延伸过程需要肌动蛋白骨架和微管系统的协同［9］，在细胞骨架组装、运动和维持微管系统稳定中具有重要调节作用的Rho在轴突再生中的作用逐渐为人们所关注。

轴突生长的驱动始于轴突生长锥中肌动蛋白不断的聚集和解聚。

轴突生长锥是轴突末端呈扇形膨大的动力学结构，由板状伪足（扇形膨大部分）和丝状伪足（板状伪足表面伸出的细小突起）组成，板状伪足主要由微管构成，丝状伪足的细胞骨架主要是不成束的肌动蛋白，由此构成生长锥向前运动的结构基础。

生长锥对周围环境极其敏感，其表面受体可识别细胞外基质中或周围细胞上的导向分子，这些导向分子中有的能够吸引生长锥向其生长、有的却是排斥生长锥向其生长，在生长锥形态发生改变之前，肌动蛋白骨架就不断的发生着聚集和解聚的改变使板状伪足和丝状伪足不断的伸缩，在复杂的环境中驱动轴突沿特定的方向向前延伸［4、10］。

在大鼠的大脑皮质中，鸡胚轴突向外生长时视网膜的神经节细胞中都有Rho和同为小分子量GTPases酶超家族成员的Cdc42、Rac的表达［9，11］，Rho和Cdc42、Rac对神经元的形态学有着重要影响。

诱导信号的诱导作用或者排斥信号的排斥作用将使生长锥转向，这些都受细胞内特定位置的Rho GTPases 活性的影响，而Rho GTPases的活性又受细胞外导向信号的影响。

Semaphorins、Ephrins、Slits和Netrins是目前已知的研究最深入的4种轴突生长导向分子，这些导向分子能被轴突生长锥表面的导向受体识别，导向受体可以通过其信号传导通路的下游作用元件调节Rho GTPases活性引起细胞骨架蛋白系统的重组介导轴突生长锥的生长［12，13］。

Semaphorins是一种在轴突生长过程中起化学排斥信号作用的分泌型蛋白质，其作用通过一系列膜蛋白受体介导，这些受体包括：neuropilin蛋白家族、plexin蛋白家族以及IG蛋白超家族的其他膜蛋白。

Vastrik 等［14，15］先后研究证实了Semaphorins的3种亚型：Semaphorin 3A（Sema3A）、Semaphorin3D（Sema3D）和Semaphorin4D（Se-ma4D）均可以介导轴突生长锥塌陷和抑制轴突的生长。

Swiercz等［15］研究发现Sema4D可以通过其膜受体分子Plexin-B1作用于PDZ-RhoGEF和LARG激活RhoA，引起原代培养的海马神经元细胞轴突生长锥的塌陷，抑制RhoA、Rho-specific GEF和PDZ-RhoGEF的活性，可以逆转Sema4D诱导的轴突生长锥塌陷过程。

Ephrins蛋白是受体酪氨酸蛋白激酶家族Eph 受体的配体分子，Ephrins蛋白分为两大类：（1）固定于胞膜上的糖基磷酯酰肌醇（GPI），称为Ephrin-A；（2）具有跨膜片段的Ephrin-B。

Ephrins蛋白通过Eph受体在轴突生长过程中传递排斥信号［12，13，16，17］，Shamah等［18］研究发现，Ephrins蛋白通过Eph受体作用于Ephexin（一种Eph受体作用的蛋白，可以抑制GEF活性），调节Rho、Cdc42和Rac1活性，完成诱导轴突生长锥塌陷的过程。

Wahl等［19］研究亦证实，培养的鸡视神经节神经元经Ephrin-A5处理后RhoA活性上调而Rac活性受到抑制，用C3酶或Y27632阻断RhoA/Rho-kinases通路，可以降低视神经节神经元轴突塌陷率。

Siit蛋白家族与其受体Robo介导了中枢神经系统中线部位轴突生长的排斥作用［12，13，20］。

在Siit或者Robo突变物种中，轴突或进入中线后不再离开，或重复穿越中线多次，导致合缝处变厚，纵轴纤维明显减少。

Siit 和Robo相互作用能阻止异常的轴突穿越中线，阻止同侧发出的轴突分化生长到对侧，并且控制轴突穿越中线后被排斥的距离，但这些仅在生长锥穿过中线时出现。

在果蝇的研究中发现Rac活性的减低参与了Robo介导的中枢神经中线的轴突生长排斥作用［21~23］。

Netrins蛋白家族是一种保守的分泌型蛋白质，在轴突生长过程中能传递吸引或排斥信号，其作用是通过DCC受体家族介导的包括UNC40、果蝇的Frazzied、Neogenin 和DCC［12，13］。

其双向信号传导功能是通过与不同的受体相互作用完成的，比如Netrins与DCC二聚体结合介导对生长锥的吸引信号，而通过UNC-5或DCC异构体传递轴突抑制信号。

在非神经细胞及成神经细胞瘤细胞的研究［24］中，发现netrin-1/DCC通路可以通过激活Rac和Cdc42诱导细胞骨架蛋白的重组，完成进轴突生长吸引信号的传递，研究还发现，抑制RhoA及其下游效应因子Rho-kinase能促进DCC对轴突生长的诱导作用。

在生长锥中，Cdc42和Rac受诱导导向信号的调控，Rho 受排斥导向信号的调控。

当生长锥向诱导信号生长时，Cdc42和Rac的活性超过Rho途径。

一个生长锥的排斥信号表现为在损害Rac途径的情况下Rho途径的激活［9］。

!"Rho/Rho激酶信号通路与轴突再生中枢神经系统损伤后，由于内环境中缺乏生长刺激因子和多种抑制分子的存在，使轴突的再生过程被阻断［9］。

研究表明，一些抑制因子可以直接或间接地影响细胞内Rho信号传导通路，这一发现为轴突再生的研究提供了新的理论基础。

目前多项研究证实，髓源性生长抑制因子Myeiin-associated giyco-protein（MAG）、Nogo-A以及Oiigodendrocyte-myeiin giycoprotein （Omgp）均可通过其共同膜受体NgR受体/p75NTR复合体激活细胞内Rho信号传导系统，引起肌动蛋白骨架的重组和轴突生长锥的塌陷，从而阻断轴突再生过程［25~27］。

在Swiss3T3细胞的研究中发现Rho能被细胞外脂质体激活，参与成纤维细胞肌动蛋白张力纤维及局部粘着复合物的形成，提示Rho 在膜受体与细胞骨架间信号传导过程中发挥重要作用。

随后的研究发现，抑制Rho激酶活性能够降低体外培养的神经元肌动蛋白网络的稳定性，增加轴突生长锥的体积和提高其运动性，启动轴突延伸过程［5］。

用肉毒梭菌源性C3胞外酶和负显性突变体抑制Rho活性后发现，阻断Rho活性可以促进神经元轴突在含有MAG的底物上生长，同时C3胞外酶阻断Rho 活性后亦促进受损的成年大鼠视神经克服胶质斑痕延伸，认为Rho在抑制神经轴突再生信号的级联传导过程中发挥关键作用。

Dergham等［8，28］在脊髓损伤动物模型研究中证实，使用C3胞外酶阻断Rho活性或使用Y-27632及Fasudii灭活其下游效应因子Rho激酶阻断Rho信号转导途径后，可促进脊髓损伤后的成年小鼠轴突再生和其后肢功能的恢复，同时在使用C3或Y27632阻断Rho/Rho激酶通路后，可促进髓源性抑制底物中原代培养的皮层神经元轴突的生长。

随后的研究发现Y-27632及Fasudii对轴突再生的促进作用具有时间和剂量依赖性，组织学分析表明，脊髓损伤4周后局部应用Fasudii对轴突再生和运动功能的恢复无效，提示Rho/Rho激酶通路的激活介导了中枢神经损伤慢性期不可逆性的轴突再生抑制作用［29］，Chan等［30］对比不同剂量Y-27632鞘内注射在成年大鼠脊髓损伤中的作用发现，对比小剂量Y-27632处理组大剂量鞘内注射抑制剂Y-27632能明显增加损伤灶周围脊髓灰质中轴突芽枝的数量，并能促进轴突越过损伤瘢痕向前延伸，足迹分析和热逃避试验结果提示大剂量Y-27632处理能促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复而小剂量Y-27632处理对脊髓损伤可能有害。