浙江农林大学生物化学--转录

3、RNA聚合酶Ⅲ催化的转录起始RNA聚合
酶Ⅲ催化tRNA，5S rRNA和7S rRNA的转录 。 tRNA基因转录的起始： tRNA基因的转录 初产物是tRNA的前体，经加工后产生多个成 熟tRNA。在DNA上的调控序列位于起始转录 位点的下游，称为内部启动子。有二个调控 区，分别位于编码tRNA D-环和Tψ环的序列 ，分别称为A盒和B盒。
1．5’帽的形成：hnRNA 5’端的第一个核苷酸通常 为三磷酸鸟苷（5’-pppGpN-），在磷酸酶催化下去 除γ-磷酸基团形成5’-ppGpN· · · ，经鸟苷酰转移酶催 化与另一个GTP（pppG）作用生成GpppGpN· · · ， 在鸟嘌呤-7-甲基转移酶作用下，以S-腺苷蛋氨酸为 甲基来源，生成m7GpppGpN· · · ，再经2’甲基转移 酶催化，使5’端原来的第一位， 甚至第二位核苷酸 的2’-O位甲基化，形成m7GpppGmN· · · ，或 GpppGpmNm· · · 。 可见5’帽结构有三种形式；m7GpppGpN· · · 为帽0， m7GpppGmpN· · · 为帽1，m7GpppGmpNm· · · 为帽2 。不同真核生物的mRNA或同一生物的不同mRNA 有不同的5’帽结构。
2、RNA聚合酶II催化的转录起始 RNA聚合酶II催化 各种前体mRNA的合成。研究表明，RNA聚合酶II 催化的转录起始需要较多的转录因子参与，分别称 为TFⅡA~J。 RNA聚合酶Ⅱ结合的启动子的特点是，转录起始点 上游有三处参与转录调控的保守序列或称为顺式作 用元件。在–90bp处有核心序列为GGGCGG的GC 盒，–70bp处有共有(consensus)序列为GGC（T） CAATCT的CAAT盒，–30bp处有共有序列为 TATAA（T）AAT的TATA盒，又称Hogness盒 (Hogness box)。转录起始点与原核生物相似，大多 数为A或G。
第十一章 转录
第一节 转录的定义
是以DNA单链为模板，NTP为原料，在
DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA 链的过程。
几个重要概念




DNA分子中能转录出RNA的区段，称为结构基因（structure gene）。 结构基因的双链中，仅有一股链作为模板转录成RNA，称为 模板链(template strand)，也称作Watson（W）链(Watson strand)、负（-）链(minus strand)或反意义链(antisense strand)。 与模板链相对应的互补链，其编码区的碱基序列与mRNA的 密码序列相同（仅T、U互换），称为编码链(coding strand) ，也称作Crick（C）链（Crick strand）、正（+）链(plus strand)，或有意义链(sense strand)。 不同基因的模板链与编码链，在DNA分子上并不是固定在某 一股链，这种现象称为不对称转录(asymmetric transcription)。。
第四节 真核生物的转录
一、真核生物与原核生物转录的区别 1、转录与翻译部位不同 2、RNA聚合酶不同 3、启动子不同 4、转录后加工不同
二、真核生物的转录过程
一)转录的起始
1、RNA聚合酶I催化的转录起始RNA聚合酶I催化前 rRNA（40S RNA）的合成。前rRNA基因转录起始 点上游有两个顺式作用元件，一个是跨越起始点的 核心元件，另一个在–100bp处有上游调控元件（ UCE）。RNA聚合酶I催化的转录需要2种转录因子 ，分别称为上游结合因子（UBF）和选择性因子1 （SL1）。SL1含有4个亚基，一个是TATA盒结合 蛋白（TBP），另3个是TBP相关因子（TAF）。 UBF与DNA结合令模板DNA发生弯曲，使相距上百 bp的UCE和核心元件靠拢，接着SL1和pol I相继结 合到UBF-DNA复合物上，完成起始复合物的组建, 开始转录 。
第二节 转录所需的条件
一、RNA聚合酶， 二、启动子（-10序列和-35序列）， 三、各种转录因子（TFA、TFB、TFD）。 四、四种NTP。
一、RNA聚合酶
转录酶（transcriptase）是依赖DNA的RNA聚合酶 （DNA dependent RNA polymerase，DDRP）， 亦称为DNA指导的RNA聚合酶（DNA directed RNA polymerase），简称为RNA聚合酶（RNA pol ）。它以DNA为模板催化RNA的合成。 原核生物和真核生物的转录酶，均能在模板链的转 录起始部位，催化2个游离的NTP形成磷酸二酯键 而引发转录的起始，因此，转录的起始不需引物， 这也是转录与复制在起始阶段的一大区别。
终止
终止原核生物转录的终止有两种主要机制。
一种机制是需要蛋白质因子ρ（Rho）的参与 ，称为依赖ρ因子(ρfactor)的转录终止机制， 另一种机制是在离体系统中观察到，纯化的 RNA聚合酶不需要其他蛋白质因子参与，可 使转录终止，称为不依赖ρ因子的转录终止机 制。

两种终止方式


1依赖ρ因子的转录终止： ρ因子是一种分子量为46kDa的蛋白质，以六 聚体为活性形式。依赖ρ因子的终止位点，未发现有特殊的DNA序列， 但ρ因子能与转录中的RNA结合。ρ因子的六聚体被约70～80 nt的RNA 包绕，激活ρ因子的ATP酶（ATPase）活性，并向RNA的3’端滑动，滑 至RNA聚合酶附近时，RNA聚合酶暂停聚合活性，使RNA∶DNA杂化链 解链，转录的RNA释放出来而终止转录。如图13-8所示。 2．不依赖ρ因子的转录终止： 在这种转录终止系统中，模板DNA在终 止位点附近有特殊的连续T序列，在连续T之前有富含GC互补区及几个 插入碱基，如图13-9。这种互补区的转录物可形成茎-环结构，影响RNA 聚合酶的构象使转录暂停；同时，由于转录产物的（rU）n与模板的（ dA）n之间的dA∶rU杂交区的双链是最不稳定的双链，使杂化链的稳定 性下降，而转录泡模板区的两股DNA容易恢复双链，释出转录产物RNA ，使转录终止。

原核生物的RNA 聚合酶
细菌中只发现一种RNA聚合酶，能催化mRNA， tRNA和rRNA等的合成，研究得比较清楚的是大肠 杆菌（E coli）的RNA聚合酶。 大肠杆菌RNA聚合酶的分子量约450kDa，由四种5 个亚基（α2ββ′σ）组成全酶（holoenzyne），σ亚 基与全酶疏松结合，在胞内、外均容易从全酶中解 离，解离后的部分（α2ββ′）称为核心酶（core enzyme）。

第六节 真核生物的转录后加工


㈠ rRNA转录后的加工 真核生物的rRNA有5S、5.8S、18S和28S四种，其中5.8S 、18S和28S是由RNA聚合酶I催化一个转录单位，产生45S rRNA前体，rRNA转录后加工包括前体rRNA与蛋白质结合 ，然后再切割和甲基化。在研究rRNA转录加工的过程中， 发现某些真核生物如四膜虫的26SrRNA的 前体为6.4kb，含 有414核苷酸的内含子，可以在完全没有蛋白质的条件下， 自身剪接，能很准确地将414核苷酸内含子剪除，而使两个 外显子相连接为成熟的26S RNA。这种具有催化功能的RNA 称为核酶（ribozyme），意为可切割特异性RNA序列的RNA 分子。
㈢
mRNA转录后的加工 真核生物mRNA由RNA聚合酶II催化转录，初 始产物为核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），新生的hnRNA从 开始形成到转录终止，就逐步与蛋白质结合 形成不均一核糖核蛋白（hnRNP）颗粒，前 mRNA加工的顺序是形成5’帽子结构；内切 酶去除3’端的一段序列；poly A聚合酶催化形 成3’polyA尾；最后是剪接去除内含子转变为 成熟的mRNA。
㈡
tRNA转录后的加工 前tRNA的加工包括切除和碱基修饰，有些则 需剪接。 前tRNA的碱基约有10%需要酶促修饰，修饰 有如下类型：①前tRNA3’端的U由CCA取代 ；②嘌呤碱或核糖C2’的甲基化；③尿苷被还 原成双氢尿苷（DH）或核苷内的转位反应， 成为假尿嘧啶核苷（Tψ）；④某些腺苷酸脱 氨成为次黄嘌呤核苷酸（AMP→IMP）。
第三节 原核生物转录的过程

起始：首先由σ因子辨认启动子的–35区，全酶与该 区结合，形成疏松的复合物，此时DNA双链未解开 ，因而称为封闭型转录起始复合物，继而RNA聚合 酶移向–10区及转录起始点，在–20区处DNA发生局 部解链，形成12～17bp的单链区，RNA聚合酶与 DNA结合更紧密，形成开放型转录起始复合物。以 单链的模板链为模板，RNA聚合酶上的起始位点和 延伸位点被相应的NTP占据，聚合酶的β亚基催化 第一个磷酸二酯键的生成，σ亚基从全酶解离，形 成DNA-RNA聚合酶（核心酶）结合在一起的起始 延伸复合物。
三、转录因子
转录因子(transcription
factor)是起正调控作 用的反式作用因子。转录因子是转录起始过 程中RNA聚合酶所需的辅助因子。真核生物 基因在无转录因子时处于不表达状态，RNA 聚合酶自身无法启动基因转录，只有当转录 因子(蛋白质)结合在其识别的DNA序列上后 ，基因才开始表达。如TFA、TFB、TFD。
延长


延长：转录延长阶段发生的反应，在原核生物和真核生物比 较相近。总的来说，一是聚合酶如何向转录起始点下游移动 ，继续指导核苷酸之间磷酸二酯键的形成，二是转录区的模 板如何形成局部单链区，便于转录。 在聚合酶沿模板链的3’→5’移动时，可按模板链碱基序列的 指引，相应NTP上的α-磷酸可与延长新链的3’-OH相继形成 磷酸二酯键，其β、γ磷酸基脱落生成焦磷酸后迅速水解，释 放的能量进一步推动转录，使新合成的RNA链沿着5’→ 3’方 向逐步延长。在转录局部形成的RNA∶DNA杂化双链之间的 引力比DNA双链的弱（因为杂化双链间存在dA∶rU配对， dA∶rU的稳定性比dA∶dT的小），延长中的RNA链的5’-端 会被重新形成的DNA双链挤出，使合成中的RNA的5’-端游 离于转录复合物。