基于PCR的染色体步移

１依赖酶切连接的PCR这类方法首先对基因组DNA酶切之后，然后让酶切产物自我成环或在酶切产物末端加上相应的接头。

以已知序列上的特异引物或接头上的锚定引物，扩增已知序列的上下游侧翼序列。

1.1 反向PCR反向PCR（inversPCR，IPCR）是Triglia等提出的扩增已知序列上游和下游未知序列的方法。

该方法的基本原理是对已知序列进行分析，选择已知序列中没有的限制性内切酶位点，酶切基因组DNA后，酶切片段环化自连，然后利用已知序列设计的反向引物，扩增已知序列两侧的未知序列，原理如图１。

因此，这种方法包含以下３个步骤：（１）基因组DNA 酶切；（２）线性酶切产物环化；（３）已知序列处设计的反向引物扩增目标片段。

在PCR 扩增之前，也可以根据已知序列用合适的内切酶将环化的DNA切割成线性DNA，这样更利于PCR反应的进行。

图1：反向PCR原理图最初，IPCR用于扩增基因组DNA的侧翼未知序列，后来利用T4聚合酶补平双链cDNA 末端后再环化，可以有效扩增已知cDNA的侧翼未知序列。

然而，IPCR存在技术缺点：（１）环化过程难以控制，基因组DNA酶切后，不同的酶切片段连接成线性串联体，致使非特异性扩增；（２）基因组DNA酶切位点随机分布，可能产生过长的酶切片段导致PCR扩增效率下降，成功率降低。

Benkel等在此基础上对IPCR的反应体系改进，可以扩增长达40Kb的片段。

Kohda等在对基因组DNA酶切之后，环化连接过程中，酶切位点之间加上一段桥连片段，有效扩增侧翼片段，这种方法称为桥连反向PCR（BI-PCR）。

BI-PCR扩增的特异性更高，操作更加简便。

最近，Tsaftaris等利用改进的滚环复制反向PCR从植物基因组DNA中成功分离出3Kb的启动子序列。

以IPCR为代表的连接成环PCR策略是首次利用PCR技术进行的染色体步移技术。

以此为基础，对基因组DNA酶切，在酶切末端加上接头或通过相应的方法在酶切末端加上已知序列，获得目标序列的PCR扩增的染色体步移技术大量涌现。

1.2 载体PCR载体PCR（single specific primePCR，SSP-PCR）是通过把基因组DNA酶切之后，连接到质粒载体（如ＳpBluescript KS）上，并用依据已知序列设计的特异引物和载体上的通用引物特异扩增目标片段的一种PCR染色体步移技术。

图2：载体PCR原理图Shyamala等利用此技术扩增出了小鼠组氨酸转运操作子的侧翼序列。

Shimada等利用改进的SSP-PCR分离了矮牵牛的P450基因的cDNA序列，并用扩增到的cDNA片段筛选出了矮牵牛的P450基因。

SSP-PCR方法的原理很简单，非特异片段虽然能够连接到质粒载体中，但非特异片段没有特异引物的结合位点，因此不能有效扩增。

但是，构建含有插入片段的质粒载体的过程比较复杂，并且操作步骤也较繁琐；当所构建文库的目标序列的拷贝数比较少时，SSP-PCR技术扩增的特异性并不高，扩增产物需要再鉴定。

因此该方法应用不是很广泛。

1.3接头PCR接头PCR（cassett PCR）是通过对基因组DNA酶切消化之后，在未知序列酶切末端加上相应的接头，利用位于接头及已知序列处的引物扩增目标序列。

这类方法一般操作步骤为：（１）利用限制性内切酶酶切基因组DNA；（２）用DNA连接酶在酶切DNA末端加上相应的接头；（３）特异引物与接头引物组合扩增目标片段。

接头DNA的５’端去磷酸化可有效防止接头的自连，并在与酶切产物连接处制造一个缺刻，抑制接头引物的非特异性扩增。

图3：接头PCR原理图PCR过程中，退火后酶切产物3’端的接头DNA就会脱落，特异引物先引导DNA合成；随后以其为模板合成目标片段。

但是在研究复杂基因组的物种时，接头PCR会产生大量的非特异性扩增，众多的研究者在此基础上对接头DNA及体系进行优化，开发了一系列改进的接头PCR。

1.3.1锅柄PCR锅柄PCR（panhandle PCR，Ｐ-PCR）由Jones等首次提出，因PCR过程中模板会形成类似锅柄状的茎环结构而得名。

Ｐ-PCR的一般流程为：（１）酶切基因组DNA，在５′端产生粘性末端；（２）单链DNA接头的５′端与酶切DNA粘性末端配对连接，连接产物纯化回收；（３）变性退火之后，单链模板上的接头与已知序列配对成双链，形成一个形似“锅柄”状的茎环结构；（４）利用特异引物与接头引物组合扩增目标片段。

图4：锅柄PCR原理图Ｐ-PCR的成功与否，就在于能否形成“锅柄”状的茎环结构。

因此接头链的５′端要与酶切末端配对连接，３′端要与部分已知序列反向互补。

Ｐ-PCR出现之后，有很多研究者对其进行了大量的改良，提出很多类似的染色体步移方法。

1.3.2 抑制PCRSiebert等参照Ｐ-PCR，设计了一种反向互补的平末端接头，接头DNA的一端可以连接在任何具有平末端酶切产物的两端，名为抑制PCR（suppression PCR）。

基因组DNA酶切加上接头，PCR过程中含有目标片段的连接产物能够利用特异引物与接头引物进行扩增；不含目标片段的连接产物退火之后便形成“锅柄状”的茎环结构，使得接头引物不能结合，从而抑制了非特异产物的扩增。

因此，这种方法又称为LMS-PCR（Ligation mediatedsuppression PCR）。

并且，在接头DNA处设计两对接头引物，第一次PCR反应之后，还可以进行第二次的半巢式PCR提高扩增产物的特异性。

图5：抑制PCR原理图这种DNA步移方法可快速获得cDNA克隆游的启动子及调控因子，鉴定基因的外显子和内含子的边界区域，以及分离序列标签位点的上下游序列。

1.3.3 步降PCRZhang等通过对接头DNA的改造，开发出了步降PCR（stepdown PCR，SD-PCR）。

SD-PCR最大的改进之处在于使用的DNA接头的两条链长度不同，两条链配对之后产生的一个粘性末端可与酶切后的DNA片段连接；短的接头DNA单链５′端加上一个磷酸基团（PO４），３′端加上一个氨基（NH2）。

连接时短链的５′端可以与酶切DNA的３′端连接，由于短接头３′端的氨基存在使得短接头不能被补平。

SD-PCR的要点是在PCR循环过程中，退火温度逐渐从72℃降低到68℃；第一轮反应只有特异引物能够引导PCR反应进行，扩增的产物作为模板用以定向扩增目的片段。

SD-PCR在控制非特异扩增方面有４条途径：（１）短接头末端的磷酸基团（PO4）和氨基（NH2）；（２）PCR反应的热启动，可以降低非特异性扩增；（３）SD-PCR循环的退火温度逐步降低，增加目标产物的产量；（４）连接反应是在两种酶的最佳酶切条件下进行，有效防止接头自连降低非特异性扩增。

图6：步降PCR原理图1.3.4 T-linker PCRYan等提出一种新的染色体步移方法，称为T-linker PCR（T-linker specific ligation PCR）。

该方法的原理步骤为：（１）用末端转移酶在基因组DNA末端加上poly（dT）n，在基因组DNA３′末端形成一串poly（dT）n，沉淀纯化DNA；（２）酶切带有poly（dT）n 的基因组DNA，在３′末端形成非单Ａ（腺嘌呤）粘性末端，纯化酶切产物；（３）使用特异引物扩增目标片段，目标DNA３′端在LATaq酶作用下产生一个单Ａ（腺嘌呤）尾巴，纯化经过处理的DNA片段；（４）T-linker（３′端有一个胸腺嘧啶尾巴）在T4连接酶的作用下特异连到目标DNA片段３′腺嘌呤末端；（５）使用特异引物与T-linker上的接头引物进行２轮巢式PCR扩增出目标片段。

图7：T-linker原理图由于T-linker特异结合到目标片段，极大提高了DNAＴ-linker PCR扩增的特异性和效率；并且T-linker只结合到目标DNA的一端，使得染色体步移具有方向性。

鉴于T-linker PCR步骤较为繁琐，并且局限于少数内切酶，Acevedo等对这种方法进行了改进。

改进的T-linker PCR 优势在于可用更多类型的内切酶进行基因组DNA的酶切，并且T-linker的５′端去磷酸化可减少非特异性扩增。

除了直接在酶切DNA末端连接接头外，还可在酶切DNA末端进行修饰之后再加接头。

典型的是Cormack等提出的RAGE方法，该方法的原理类似于RACE。

基因组DNA酶切之后，３′末端加上一串腺嘌呤再加上接头；接头引物与特异引物组合用来合成特异片段。

2.不依赖酶切连接的PCR依赖酶切连接的PCR扩增染色体步移方法在出现之初，其应用就受限于序列中的酶切位点数目。

很多研究者试图解决这个问题，开发了一些不需要酶切连接的染色体步移方法。

Paeker等在1991年就提出使用半随机引物扩增未知序列的设想，Lin等在1995年就规范了利用特异引物与随机引物扩增目标序列的操作流程。

使用随机引物和特异引物对基因组扩增，然后进行一次半巢式PCR得到目标片段。

为了有效地扩增目标片段，退火温度通常很低，随机引物也较正常引物短。

这种方法虽然简便易行，但是目标片段只是随机扩增，非特异性扩增现象较严重。

2.1 TAIL-PCRLiu等对随机引物以及PCR过程进行改进，使得非特异性扩增产物得到有效抑制，开发出热不对称交错PCR（therm alasymmetric inter laced PCR，TAIL-PCR）。

TAIL-PCR的原理是根据已知的DNA序列设计３条序列较长的、退火温度较高的特异引物，与位于未知序列处的随机简并引物（arbitrary degenerate primer，AD primers）组合，进行２次巢式PCR（nested PCR），从而获得目的产物。

锚定在已知序列处的特异引物的方向是由已知序列指向未知侧翼序列（即引物的５′端远离未知序列）；引物长度为25～27个碱基，退火温度较高。

另外一端的简并引物较短，碱基数为14个左右，退火温度较低。

并且巢式特异引物的退火温度至少要比AD引物的退火温度高10℃，AD引物的退火温度大约为46℃，巢式特异引物的退火温度一般是58～65℃。

因此，PCR过程中，在高退火温度条件下，特异引物能较好地与已知序列上的位点相结合，而随机引物则不能很好地与模板DNA结合；而低温度条件下，两条引物链与模板DNA的结合效率相同。

所以，在高严谨循环与低严谨循环交替进行时，由于引物退火温度的不对称，使得目标产物的量提高，随机引物自我配对扩增的非目标产物的量受到抑制。

接下来利用巢式PCR进一步提高目标产物的量，从而达到特异扩增目标产物的目的。

图8：TAIL PCR原理图TAIL-PCR过程中，会产生三种类型的扩增物：（１）随机引物与特异引物扩增的目标产物（Ⅰ型）；（２）特异引物自为引物对扩增的非特异产物（Ⅱ型）；（３）以及由随机引物自为引物对扩增的非特异产物（Ⅲ型）。