3.光学显微镜分类及观察方法
实验一 普通光学显微镜的使用和细菌形态观察
实验一普通光学显微镜的使用和细菌形态观察一、实验目的1．了解普通光学显微镜的构造和原理。
2．学习并掌握普通光学显微镜——油镜的使用方法。
3．利用油镜观察细菌的形态和构造。
二、实验原理微生物学研究用的普通光学显微镜通常有低倍物镜（16mm，10×）高倍物镜（4mm，40-45×）和油镜（1.8mm，95-100×）三种。
油镜常标有黑圈或红圈（或白圈），它是三者中放大倍数最大的。
使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。
这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n＝1.52，与玻璃基本相同。
当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。
如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了（图Ⅰ-1）。
图Ⅰ-1油镜的原理图Ⅰ-2 镜口角利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。
因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。
所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NA=nsinθ数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。
可分辨两点之间的最小距离=λ/2NA＝λ/2nsinθ式中λ：所用光源波长；θ：为物镜镜口角的半数，取决于物镜的直径和工作距离。
n：玻片与物镜间介质的折射率，空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）、玻璃（n=1.52）等。
nSinθ：数值孔径（NA），是决定物镜性能的最重要指标。
由上述可知若n值和α角越大则NA越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大（图Ⅰ-2）。
三、实验器材1．仪器：显微镜。
2．材料：标本片（大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、八叠球菌、炭菌杆菌的芽孢和荚膜、细菌三形涂片），香柏油，二甲苯，擦镜纸等。
显微镜种类及使用方法
显微镜的种类及其使用方法一、光学显微镜光学显微镜是一种精密的光学仪器。
当前使用的显微镜由一套透镜配合，因而可选择不同的放大倍数对物体的细微结构进行放大观察。
普通光学显微镜通常能将物体放大1500～2000 倍(最大的分辨力为0.2μm)。
（一）光学显微镜的基本结构（附图1）1．光学部分包括目镜、物镜、聚光器和光源等。
（1）目镜通常由两组透镜组成，上端的一组又称为“接目镜”，下端的则称为“场镜”。
两者之间或在场镜的下方装有视场光阑（金属环状装置），经物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面上，所以其上可加置目镜测微尺。
在目镜上方刻有放大倍数，如10×、20×等。
按照视场的大小，目镜可分为普通目镜和广角目镜。
有些显微镜的目镜上还附有视度调节机构，操作者可以对左右眼分别进行视度调整。
另有照相目镜(NFK)可用于拍摄。
（2）物镜由数组透镜组成，安装于转换器上，又称接物镜。
通常每台显微镜配备一套不同倍数的物镜，包括：①低倍物镜：指1×～6×；②中倍物镜：指6×～25×；③高倍物镜：指25×～63×；④油浸物镜：指90×～100×。
其中油浸物镜使用时需在物镜的下表面和盖玻片的上表面之间填充折射率为1.5 左右的液体（如香柏油等），它能显著地提高显微观察的分辨率。
其他物镜则直接使用。
观察过程中物镜的选择一般遵循由低到高的顺序，因为低倍镜的视野大，便于查找待检的具体部位。
显微镜的放大倍数，可粗略视为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。
（3）聚光器由聚光透镜和虹彩光圈组成，位于在载物台下方。
聚光透镜的功能是将光线聚焦于视场范围内；透镜组下方的虹彩光圈可开大缩小，以控制聚光器的通光范围，调节光的强度，影响成像的分辨力和反差。
使用时应根据观察目的，配合光源强度加以调节，得到最佳成像效果。
（4）光源较早的普通光学显微镜借助镜座上的反光镜，将自然光或灯光反射到聚光器透镜的中央作为镜检光源。
显微镜的结构及使用方法
光学显微镜的结构及使用方法
一、光学显微镜的基本结构：
目镜—--—长的放大倍数小
镜头
1、光学结构物镜---—长的放大倍数大
反光镜（平面镜、凹面镜）-—--调节视野亮度粗、细准焦螺旋-——使镜筒上升或下降，调节物像清晰度。
2、机械结构转换器————更换不同放大倍数的物镜
光圈—-—-调节视野亮度（有大小之分）
二、光学显微镜的成像:
1、倒立的虚像。
2、放大倍数实质是指放大物体的长度或宽度。
3、放大倍数的计算：物镜放大倍数×目镜放大倍数。
三、光学显微镜的一般使用方法：
1、取镜与安放:
2、对光：
①转到转换器，使低倍物镜对准通光孔。
②选较大的光圈对准通光孔,左眼注视目镜，转动反光镜,直到看到白亮的视野。
3、低倍镜的观察:
①把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住,标本要正对通光孔的中心。
②转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（此时实验者应该在侧面看物镜与玻片，避免相撞）。
③左眼看目镜内,同时反向缓缓转动粗准焦螺旋使镜筒上升,直到看到物像为止，再稍稍转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。
4、高倍镜的观察:
①低倍镜换高倍镜的一般步骤是怎样的？
②低倍镜换上高倍镜后物镜与玻片的距离有何变化？视野的亮度、大小有何变化？观察到的细胞体积、细胞数目有何变化？
③如果在视野中发现有污点，则污点的位置可能在什么部件上？如何来判断污点所在的位置？。
光学显微镜的分类及应用领域
显微镜的主要分类、功能及应用领域一、显微镜的分类(一)、按使用目镜的数目可分为单目、双目和三目显微镜。
单目价格比较便宜，可以作为初学爱好者的选择，双目稍贵点，观察的时候两眼可以同时观察，观察得舒适些，三目又多了一目，它的作用主要是连接数码相机或电脑用，比较适合长时间工作的人员选用。
(二)、根据其用途以及应用范围分为生物显微镜、金相显微镜、体视显微镜等。
1、生物显微镜是最常见的一种显微镜，在很多实验室中都可以见到，主要是用来观察生物切片、生物细胞、细菌以及活体组织培养、流质沉淀等的观察和研究，同时可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。
生物显微镜供医疗卫生单位、高等院校、研究所用于微生物、细胞、细菌、组织培养、悬浮体、沉淀物等的观察，可连续观察细胞、细菌等在培养液中繁殖分裂的过程等。
在细胞学、寄生虫学、肿瘤学、免疫学、遗传工程学、工业微生物学、植物学等领域中应用广泛。
2、体视显微镜又称为实体显微镜、立体显微镜，解剖镜，是一种具有正像立体感的目视仪器，广泛的应用于生物学、医学、农林等。
它具有两个完整的光路，所以观察时物体呈现立体感。
主要用途有：①作为动物学、植物学、昆虫学、组织学、考古学等的研究和解剖工具。
②做纺织工业中原料及棉毛织物的检验。
③在电子工业，做晶体等装配工具。
④对各种材料气孔形状腐蚀情况等表面现象的检查。
⑤对文书纸币的真假判断。
⑥透镜、棱镜或其它透明物质的表面质量，以及精密刻度的质量检查等。
3、金相显微镜主要是用来鉴定和分析金属表面组织结构，是金属学研究金相的重要仪器，是工业部门鉴定产品质量的关键设备，专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。
这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。
不仅可以鉴别和分析各种金属、合金材料、非金属物质的组织结构及集成电路、微颗粒、线材、纤维、表面喷涂等的一些表面状况，金相显微镜还可以广泛地应用于电子、化工和仪器仪表行业观察不透明的物质和透明的物质。
光学显微镜
物镜数值孔径
三、显微镜的几个基本概念
显微镜的分辨率和放大倍数是两个互相联系的性能 参数；
选用物镜数值孔径不够大，分辨率不够高时，显微 镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度增大放 大倍数，得到的图像只是一个轮廓虽大但不清晰的 图像，此时的放大率称为无效放大倍数；
如果分辨率很高而放大倍数不足时，如果图像太小 仍然不能被人眼清晰地观察。
（十）工作距离
工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被 检物体之间的距离。 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。
四、显微镜的结构
光学放大系统 目镜
物镜 光源 折光镜
组成
照明系统
聚光镜 滤光片
机械和支架系统
光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 载物台和切片夹 (Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course and fine focus knob) 7. 目镜(Oculars) 8. 照相机等接口 (Connection to camera, etc.)
三、显微镜的几个基本概念
（一）光源：能发射光波的物体,物理学上指 能发出一定波长范围的电磁波（包括可见光 与紫外线、红外线和X光线等不可见光）的 物体。通常指能发出可见光的发光体
可见光频率范围：7.5×1014 - 3.9×1014 Hz。 真空中对应的波长范围：390nm – 760nm 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红
瞳距调节
屈光度调节
光学显微镜的使用及菌体观察
实验光学显微镜的使用及菌体观察一、实验原理1.普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。
当前使用的显微镜都是由一套透镜组成的。
普通光学显微镜通常能将物体放大 1500-2000倍。
分辨率（可辨出两点间最小距离），公式如下：D=0.5λ/n*sinα/2公式中：λ为所用光源波长；α为物镜镜口角；n为玻片与物镜间介质的折射率。
最短可见光450nm。
空气n=1.0；水n=1.33；香柏油n=1.52。
光学显微镜在最短波长450nm，用油镜其最大的分辨率为0.18μm。
肉眼正常德分辨率为0.25mm。
因此光学显微镜有效的最高总放大倍数能达到1000~1500倍。
根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。
紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。
数值孔径（numeri cal apeatu re简写为NA）是物镜的主要参数，是决定物镜性能的最重要指标。
数值孔径可用下式表示：N A= n* sinα/2镜口角α总是小于180°。
因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1，一般为0.05~0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为1.515）浸没，则数值孔径最大可接近1.5。
虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。
通常在实用范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4。
2. 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞常带负电荷，而碱性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
高一显微镜知识点归纳
高一显微镜知识点归纳在高一生物学学习中，显微镜是一项非常重要的工具。
它可以帮助我们观察微小的细胞结构和微生物，深入了解生物的奥秘。
为了帮助同学们更好地掌握显微镜的知识，下面将对高一显微镜知识点进行归纳。
一、显微镜的分类和组成显微镜可以分为光学显微镜和电子显微镜两大类。
光学显微镜又可分为简单显微镜和复合显微镜。
1. 简单显微镜：由一个凸透镜构成，只能放大物体一定倍数，并且不能调焦。
2. 复合显微镜：由物镜、目镜、光源和调焦机构等组成。
物镜可以放大物体20倍至100倍不等，目镜放大10倍。
最终显微镜的放大倍数为物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。
二、显微镜的使用方法1. 准备工作：清洁显微镜镜头与物镜，调节光源亮度。
2. 调焦：先用粗调焦轮将物镜放置在离玻璃片约1厘米处，然后通过转动细调焦轮逐渐拉近物镜与玻璃片的距离，直到物镜与玻璃片接触并调整清晰。
3. 观察物体：将待观察的物体放在玻璃片上，将玻璃片放在物镜下方，用夹子夹紧。
通过调节细焦距轮，使目标物体清晰可见。
4. 视野调整：当视野不够明亮或物体偏离中心时，可通过调整光源亮度和物镜位置来进行调整。
三、显微镜常见问题与解决方法1. 视野太暗：检查显微镜光源是否打开，并适当调节亮度。
也可能是目镜或物镜上有灰尘，需要及时清洁。
2. 物体模糊：先通过细焦距轮逐渐调整焦距，如果仍然模糊，可能是物镜或目镜不够清洁，需要擦拭。
3. 调焦困难：有时调焦轮过紧或过松会导致调焦困难，可以适当调整调焦轮松紧度。
四、显微镜的应用领域显微镜在科学研究、医学、生物学等领域有着广泛的应用。
以下是显微镜在不同领域的应用举例：1. 科学研究：通过显微镜的放大功能，科学家可以观察微小颗粒和细胞结构，研究物质的组成和属性。
2. 医学：显微镜在医学领域用于观察细菌、病毒和人体组织细胞，帮助医生进行疾病的诊断和治疗。
3. 生物学：显微镜是生物学研究中不可或缺的工具，可以观察植物和动物的细胞组织、细胞器和细胞分裂过程。
光学显微镜的结构及使用
光学显微镜的结构及使用光学显微镜（Optical Microscope）是一种通过光学方式来观察微观物体的仪器，它是一种广泛应用于生物学、药学、医学、材料科学等领域的重要工具。
光学显微镜的主要结构包括光源、凸透镜、物镜、目镜、载物台等组成部分。
在使用光学显微镜时，首先需要将待观察的样品放置在载物台上，调整光源和透镜的位置，通过调节目镜和物镜的距离和焦距，可以观察到样品的细微结构和细胞组织。
下面将详细介绍光学显微镜的结构及使用方法。
1.光源：光源是光学显微镜的一个重要组件，它用来提供光线，使样品被照亮。
常见的光源有白光源以及透射式或反射式的激光器光源。
2.凸透镜：凸透镜通常用于聚焦和放大光线。
它位于光源和样品之间，可以调整光线的聚焦度。
3.物镜：物镜是位于样品下方的镜头，它是放大样品的主要部分。
物镜通常有多个镜片组合而成，不同的物镜具有不同的放大倍数和焦距。
常用的物镜有4X、10X、40X、100X等。
4.目镜：目镜是位于物镜上方的镜头，用于放大和观察样品。
目镜通常有10X或者15X的放大倍数。
5.载物台：载物台是用来放置待观察的样品的平台。
它通常是一个可移动的平台，可以通过调节螺旋装置来调整样品的位置。
6.焦距调节装置：焦距调节装置用于调整物镜和目镜之间的距离，以便观察不同放大倍数下的样品。
使用光学显微镜的步骤如下：1.打开光源，调整适当的亮度，使样品得到充分的照明。
2.将待观察的样品放置在载物台上，固定好位置。
3.通过调节载物台的高度，使样品与物镜保持适当的距离，准备观察。
4.眼睛对准目镜，通过调节焦距和目镜的调焦装置，使样品清晰地显示在目镜中。
5.如果需要更高的放大倍率，可以通过旋转物镜转盘来切换不同的物镜。
注意，在切换物镜时需要调整焦距。
6.观察到感兴趣的结构后，可以通过移动载物台或者调节显微镜的焦距，来寻找更小的细节。
7.观察结束后，关闭光源，并将样品从载物台上移开。
1.在观察之前，确保透镜表面干净。
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体颗粒等
• 散射效应 • 暗背景，样品闪亮 • 分辨率降低，但优异的外部形态 • 如：细菌（密螺旋体），银增强等
集成调制反差 IMC –Integrated Modulation Contrast
三维立体图像 斜照明 狭缝照明 不需要特殊物镜 可用于塑料培养皿
用于体内标记的y (Sigma Aldrich) Alexa Fluor (Invitrogen) BODIPY (Invitrogen) Cy-dyes FluoProbes (Interchim) DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce) DY and MegaStokes Dyes (Dyomics) MitoTracker Sulfo Cy dyes (CYANDYE, LLC)
– 明场 – 暗场 – IMC – 荧光
明场（Bright Field）
染色（明场观察） • 通过对样品染色给予反差 • 如：H&E染色, Gram染色等
暗场（Dark Field）
实际是暗场照明法。不直接观察到照明的光线，而观察到的是被 物体反射或散射的光线。
适用范围： 生物样品：微小水生生物、纤维、
显微镜观察方法
目录
• 光学显微镜分类 • 显微镜的观察方法
光学显微镜分类
• 宽场显微镜有正置和倒置显微 镜（这两者也合称复合式－ Compound microscopes)， 以及体视显微镜。
• 共聚焦（激光扫描）显微镜两 大类
正置显微镜 倒置显微镜 体视显微镜
复合式显微镜观察方法（反差增强方法）
通过聚光镜狭缝斜照明产生的立体 浮雕效果可以配合明场物镜使用
通过调节 IMC 模块可以优化 IMC 的观察效果
荧光(Fluorescence)
荧光发光原理
FITC
FITC / Rhod
Rhod
merged
Bovine endothelial cells
荧光样品染色标记类型
• 荧光染料的免疫细胞化学法 • 荧光探针 • 荧光蛋白基因转染
Emission spectra for the Alexa Fluor dye series （life technology）
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