安捷伦液相色谱柱的选择与保养课件
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常用液相色谱柱原理及使用与维护保养ppt课件
液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板 （滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。 色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系 列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。 运载溶剂（Shipping Solvent）：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后 饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。 保存条件（Storage Conditions）：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及 其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同 要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净 化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存温度。 保存溶剂（Storage Solvent）：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与
离子基团（磺酸盐/季铵碱）的固定相，又分为强酸性、强碱性、
弱酸性、弱碱性等不同规格。用于分离解离性较强的有机盐类 化合物。（注意：不要同离子色谱混淆，离子色谱主要是分离 无机盐类化合物或某些带点离子。）
6
1.3.2聚合物基质柱
聚合物基质柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙 烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝胶作为主要填料的一类色 谱柱。其相对于硅胶柱具有更强的疏水性及更宽泛的pH范围 （1.0～14.0），但柱效较低，目前主要应用于凝胶渗透色谱 （GPC）、凝胶过滤色谱（GFC）及分子排阻色谱（MEC）。 主要用于分离蛋白质类等大分子化合物。
属中等级性柱，普适性 好；保留适中，可用于 正相与反相。
适用于在ODS上无保留或分离 时间太长的组分的分离，以及样 CN（氰基） 品中同时含有亲水与疏水性化合 物而在ODS上色谱优化困难的 场合，也可用于氨基酸分析。
HPLC安捷伦高效液相使用维护常见问题PPT课件
启动液相色谱仪器的流程
流动相冲洗系统
水相走A、D泵，有机 相走B、C泵，可防止
缓冲盐析出
流动相配制后，先使用过滤装置过滤，然后超声15min，排除气泡干扰。流速 1ml/min，使用流动相冲洗系统至少30min，待基线平稳即可进行下一步操作。
进样测定 具体操作如下：点击“序列”-“序列表”-输入相关信息确定（样品瓶、样品 名称、方法名称-TEST、进样次数、进样量）-“开始序列”。待进样结束后， 进行下一步操作。 注意：在进样前，最好用100%甲醇进行洗针，以防进样针中残留的其它样品 影响实验结果。
稳定性考察： 取同一份供试品溶液，分别于不同时间进样测定（如0、2、4、6、8、10、12、 24h）。
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
第5页/共42页
一些商品化仪器
流动相
脱气装置
四元泵
样品盘 柱温箱 检测器
第6页/共42页
溶剂
棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。 经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。
第7页/共42页
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源
打开泵、自动进样器、检测器电源，打开计算机启动 “1260联机工作站”，待
标准加样回收---已知浓度样品中加入药品
数据要求： 在规定范围内，至少用9个测定结果
进行评价。例如，设计3个不同浓度，每个 浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。
第27页/共42页
分析方法的建立及验证
绝对回收率=提取回收率/（1－基质效应），HPLC中基质效应为0 1.绝对回收率=提取回收率=萃取回收率，是用药品加血浆经萃取处理后的进 样峰面积除以该药品溶液直接进样峰面积的比值，一般来说，该比值不可能 超过100%，能做到80%就不错了。以前国家对绝对提取率还有些要求，现在 随着lc-ms的应用，最低定量限已经能做到很低，也就不需要再对绝对回收率 提具体要求，只要相对回收率满意就可以。--生物样品：用于筛选提取溶剂， 可以低但要稳定 2.相对回收率=方法学回收率，是血浆处理后的进样峰面积代入血浆标准曲 线，计算所得浓度除以真实血样浓度.该比值在100%左右.一般要求高、中浓 度点在15%以内，低浓度点可适当放宽。--内标的相对回收率值与绝对回收 率要求类似 (1)举例：10ng A药加入1ml空白血浆（10ng/ml），经萃取处理后用0.5ml流动 相复溶，进样所得峰面积8000;配制对照溶液（浓度10ng/0.5ml=20ng/ml）， 进样所得峰面积假设为10000.那么萃取回收率为8000/10000=80%.
安捷伦色谱柱选择与色谱柱维护保养讲课文档
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/ A N/ A nd 130 57 76 nd N/ A N/ A nd 2900 N/ A 40 300 38 65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
固定相键合 二甲基硅烷
CH 3
O Si R
+ OH CH 3
OH CH 3
O Si R
CH 3
CH 3
Cl Si CH 3
CH 3
( TMS)
封端 四甲基硅烷
CH 3
O Si R
CH 3
OH
CH 3
O Si CH 3 CH 3
CH 3
O Si R
第19页，共62页。
安捷伦专利的空间位阻保护
键合相 流失, 保留减弱
6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0
10
Time (min)
待测物pKa+1.5以外 的流动相pH
可保证方法的稳定性
第26页，共62页。
Zorbax色谱柱发展史
1973 ZORBAX SIL
发明专用于HPLC分离的球状、小颗粒硅胶(专利)
• 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
第11页，共62页。
C-18柱---性能影响因素
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球 型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
安捷伦的色谱柱的介绍及选择
8
Agilent LC colmns
4
Zorbax主要的键合相
Zorbax硅胶颗粒
StableBond
二异丙基 二异丁基键合
Rx-C18/Sil
二甲基十八烷基硅烷
EclipsePlus/XDB
二甲基键合 双封端
Bonus-RP
酰胺嵌入 三封端
Extend-C18
双齿键合 双封端
SB-C18 二异丁基-C18
行业领先的峰形 更好的专利技术处理硅 胶基质 改进的双封端技术：改 进的键合试剂及键合过程
更加严格的质控标准，批与批 之间更加好的重现性
不同粒径 – 1.8, 3.5, 5um
最高的分离效率 C18，C8，PAH, 苯基-己基
•致密键合 •双封端 •超纯坚固的ZORBAX硅胶 •宽的 pH使用范围2-9
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/A N/A nd 130 57 76 nd N/A N/A nd 2900 N/A 40 300 38 65 230 N/A N/A N/A N/A
Agilent 液相色谱柱
高通量和LC/MS柱
Zorbax 高通量柱，LC/MS 色谱柱 Zorbax 快速分离柱 Zorbax 快速分离高通量柱 Zorbax 溶剂节省色谱柱 Zorbax 微径色谱柱 Zorbax 毛细管柱和纳流柱
安捷伦HPLC色谱柱选择与色谱柱维护保养67页PPT
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❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
Agilent液相色谱柱的选择与日常维护
•ODS柱都是一样的吗？
•硅胶类型： 不定形硅胶，球形硅胶 柱容量，充填均匀度
•硅胶纯度： 金属含量，填料酸性
峰形
•填料颗粒尺寸：粒径大小分布，均匀度 充填均匀度，流速相关性
•填料孔径： 7～12nm，30nm
适用的化合物分子量范围
•键合密度： 含碳量
容量因子，保留时间
•键合方式： 键合相修饰
选择性，水性流动相的耐受性
Ø最高的分离效率 Ø更加可靠的长期性能可以广 泛应用于QA/QC
New!
•致密键合 •双封端 •不同粒径 – 1.8, 3.5, 5um
•坚固的硅胶基质 •快速及超快速分离
•对于所有样品都有较好的
峰形
•专利技术 •完整的质控过程 –
•方法开发的首要选择
Eclipse XDB
ØC18, C8, 苯基, CN Ø对于快速方法开发有很广泛 的应用谱图库 Ø多种色谱柱规格，从毛细柱 到制备柱 Ø 使用1.8um 颗粒实现快速有 效的方法转化
•柱填料量： 柱床实密性
柱容量
•封端技术： 屏蔽硅醇基，二次化学平衡 峰形，选择性
•pH适用范围
2006-11-30
22
Page 22
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ZORBAX 不同色谱柱的选择性
Zorbax SB C18( 150*4.6mm, 5um) USP Tailing: 1.157 Plates:8463
青果丸
色谱柱：Zorbax SB C18, 4.6×250mm, 5µm 流动相：甲醇-0.36%磷酸溶液（43:57）
16.171
mAU 50
40
安捷伦的色谱柱的介绍及选择
D250oC O2 孔径
80A & 300A
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
ZORBAX Rx
多孔硅胶微球
安捷伦拥有此项填料专利技术
8
Agilent LC colmns
4
Zorbax主要的键合相
Zorbax硅胶颗粒
StableBond
二异丙基 二异丁基键合
Rx-C18/Sil
Zorbax Eclipse XDB-C18 (B类硅胶)
普通硅胶（A类）
由于带负电荷的残留硅羟基和酸 性表面上金属含量高 (硅羟基的 pKa低), 导致碱性化合物发生拖 尾
高纯硅胶 (B类)
ZORBAX SB-C18 (B类硅胶)
由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
ODS (A类硅胶) 封端
Eclipse StableBond
柱装填
• 具可追溯性 • 可定购生产批号不同的色谱柱 • 特殊规格定制ExtendBo Nhomakorabeaus RP
4
Agilent LC colmns
2
ZORBAX®硅胶类型
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面 上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致 碱性化合物发生拖尾
高通量和LC/MS柱
Zorbax 高通量柱，LC/MS 色谱柱 Zorbax 快速分离柱 Zorbax 快速分离高通量柱 Zorbax 溶剂节省色谱柱 Zorbax 微径色谱柱 Zorbax 毛细管柱和纳流柱
生化分析柱
Zorbax 300 SB 柱 Zorbax 300Extend柱 Zorbax Poroshell柱 Zorbax Eclipse AAA柱 Zorbax GF-250/450 凝胶柱 Zorbax Oligo HPLC柱 Zorbax SAX和SCX柱 MARS mRP column
液相色谱柱的选择与使用.pptx
1、色谱柱的安装
色谱柱安装前要确认柱接头及管路是否相匹配 为了减少死体积，连接管路尽可能使用内径较小、长度较短的 管线 安装时柱箭头方向要与流动相的流向一致 分析较复杂的样品建议在分析柱前端安装保护柱。
— 7— 7—
色谱柱的安装
分析仪器使用与维护
— 8— 8—
二、色谱柱的使用
分析仪器使用与维护
分析仪器使用与维护
常用于分离极性化合物
— 4— 4—
一、色谱柱的选择
分析仪器使用与维护
常用于非极性或极性较小的样品
— 5— 5—
二、色谱柱的使用
色谱柱的安装 色谱柱的使用条件 色谱柱的平衡 柱效能测试 色谱柱的冲洗和保存
分析仪器使用与维护
— 6— 6—
二、色谱柱的使用
分析仪器使用与维护
— 15—— 15 —
小结
分析仪器使用与维护
二、色谱柱的使用
正确安装色谱柱 应用时要注意pH值、压力、温度等使用条件使用条件 每次分析样品前要用流动相充分平衡色谱柱 定期进行柱的效能测试 每次样品分析结束后要对色谱柱进行充分的清洗，并用适当 的溶剂保存色谱柱
— 16—— 16 —
课后练习和拓展
— 10—— 10 —
二、色谱柱的使用
分析仪器使用与维护
4、柱的效能测试
新购的色谱柱，使用前进行柱效能测试，并保存测试结果 在色谱柱使用期间，还要定期检测柱效 做柱效能测试时，要按照色谱柱出厂报告中的条件进行
— 11—— 11 —
二、色谱柱的使用
5、色谱柱的冲洗和保存
存放前充分冲洗 合适的存放溶剂 接好堵头，避免固定相干涸 适宜的存放环境
新色谱柱以及长时间未用的色谱，使用前最好用强溶剂在低流量下 ( 0.2—0.3ml/min)冲洗30 min
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色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸 O 流速: 0.75 mL/min CH 3 CHO 温度: RT CH H 2 3C 检测器: UV 282 nm HC
HO OCH 3 O O OCH 3 CH 2 CH 2 O H 3C O HO 3 O O O H
C-18柱---性能影响因素
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 物理性质
•颗粒形状
•粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率 •封端
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
• 球型或不规则型
粒径
• 平均颗粒直径, 通常3-10µm
Zn 1 88
< 1 nd
N/ A N/ A nd
130 57
nd N/ A N/ A nd
2900 N/ A 40
65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质,
<1ppm); 99.995% 纯度的二氧化
ZORBAX®生产工艺
3.5µm
5µm
7µm
C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为 重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW 4, 样品 MW > 4, 000, 000, 选择 80Å 的孔径 选择 300Å 的孔径
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
Na 10 17 56
K <3 nd
金属浓度（ppm) Mg Al Ca Ti 4 nd 1.5 57 300 2 9 38 nd 32
Fe 3 21 76
Zr nd 88
Cu nd
Cr nd
分子量虽小但 hydrodynamic volum (水动力学体积)较大的分子
N CH 3 O CH 3 O HO CH 3 O H CH 3
• StableBond • Eclipse XDB • Bonus-RP • Extend
硅胶 + 脲 (pH=2) + 甲醛 CH2O
D O2
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
250oC
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx
多孔硅胶微球
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
固定相 - 非极性
流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
柱填料基质
高或低pH下, 硅胶会溶解 化学修饰困难
• 硅胶基质- pH 3~8 • Al2O3 . nH2O - pH1~14 - pH1~14
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有 • 聚合物基质 机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
样品
离子化
用硅胶的正相模式 离子交换模式 溶于有机溶剂 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
分子量>2, 000
溶于水
大孔填料的离子交换模式
用大孔填料的反相模式
正相 &反相色谱
正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相 固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
反相分配色谱
极性:固定相 < 流动相
安捷伦科技
Sa
HPLC色谱柱选择与维护保养
分离模式的选择
溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水 溶于有机溶剂
用硅胶的正相模式
用键合相的正相模式 用键合相的反相模式
用键合相的反相模式
分子量<2, 000 溶于四氢呋喃 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式 溶于水
非离子化
抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式
表面积
• 颗粒外表面和内部孔表面的总和,
示
以m2/gram表
孔径
• 颗粒的孔或腔的平均尺寸,
范围80-300Å
C-18柱---性能影响因素
色谱柱化学性质
键合类型
• 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
碳覆盖率
• 与基体物质相连的键合相的量
封端
来
• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起
大孔径填料适用于大分子分析
* * 大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时 , 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
球形
不规则形
1.8µm
C-18柱---性能影响因素
色谱柱尺寸 --- ຫໍສະໝຸດ 色谱分离的影响• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 柱压低 运行时间长
• 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
C-18柱---性能影响因素
C-18柱---性能影响因素
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
孔径,
选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得 最佳峰形
0.20 0.18
0.16 0.14
分子量对峰宽的影响(梯度分离)
300SB-C18 (300Å) SB-C18 (80Å)
PW 1/2
0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0
300Å 孔径可改善大分子的峰形
HO OCH 3 O O OCH 3 CH 2 CH 2 O H 3C O HO 3 O O O H
C-18柱---性能影响因素
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 物理性质
•颗粒形状
•粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率 •封端
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
• 球型或不规则型
粒径
• 平均颗粒直径, 通常3-10µm
Zn 1 88
< 1 nd
N/ A N/ A nd
130 57
nd N/ A N/ A nd
2900 N/ A 40
65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质,
<1ppm); 99.995% 纯度的二氧化
ZORBAX®生产工艺
3.5µm
5µm
7µm
C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为 重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW 4, 样品 MW > 4, 000, 000, 选择 80Å 的孔径 选择 300Å 的孔径
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
Na 10 17 56
K <3 nd
金属浓度（ppm) Mg Al Ca Ti 4 nd 1.5 57 300 2 9 38 nd 32
Fe 3 21 76
Zr nd 88
Cu nd
Cr nd
分子量虽小但 hydrodynamic volum (水动力学体积)较大的分子
N CH 3 O CH 3 O HO CH 3 O H CH 3
• StableBond • Eclipse XDB • Bonus-RP • Extend
硅胶 + 脲 (pH=2) + 甲醛 CH2O
D O2
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
250oC
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx
多孔硅胶微球
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
固定相 - 非极性
流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
柱填料基质
高或低pH下, 硅胶会溶解 化学修饰困难
• 硅胶基质- pH 3~8 • Al2O3 . nH2O - pH1~14 - pH1~14
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有 • 聚合物基质 机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
样品
离子化
用硅胶的正相模式 离子交换模式 溶于有机溶剂 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
分子量>2, 000
溶于水
大孔填料的离子交换模式
用大孔填料的反相模式
正相 &反相色谱
正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相 固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
反相分配色谱
极性:固定相 < 流动相
安捷伦科技
Sa
HPLC色谱柱选择与维护保养
分离模式的选择
溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水 溶于有机溶剂
用硅胶的正相模式
用键合相的正相模式 用键合相的反相模式
用键合相的反相模式
分子量<2, 000 溶于四氢呋喃 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式 溶于水
非离子化
抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式
表面积
• 颗粒外表面和内部孔表面的总和,
示
以m2/gram表
孔径
• 颗粒的孔或腔的平均尺寸,
范围80-300Å
C-18柱---性能影响因素
色谱柱化学性质
键合类型
• 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
碳覆盖率
• 与基体物质相连的键合相的量
封端
来
• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起
大孔径填料适用于大分子分析
* * 大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时 , 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
球形
不规则形
1.8µm
C-18柱---性能影响因素
色谱柱尺寸 --- ຫໍສະໝຸດ 色谱分离的影响• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 柱压低 运行时间长
• 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
C-18柱---性能影响因素
C-18柱---性能影响因素
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
孔径,
选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得 最佳峰形
0.20 0.18
0.16 0.14
分子量对峰宽的影响(梯度分离)
300SB-C18 (300Å) SB-C18 (80Å)
PW 1/2
0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0
300Å 孔径可改善大分子的峰形