甲醛滴定法测定氨基氮
甲醛滴定法测定食品中的氨基酸酸含量
食品中氨基酸含量的测定————甲醛滴定法一、原理氨基酸是具有氨基和羧基的氨基酸，在溶液中以两性离子形态存在，当向溶液中加入碱时，氨基上的氢离子解离出来与羟基结合生成水。
使溶液ph不会急剧上升，但当氨基上的氢离子全部解离时则溶液的pH急剧上升，氨基上氢离子的解离常数值通常在9以上，滴定终点pH在12以上，没有适当的指示剂，为此，可用甲醛与氨基酸作用，氨基上的两个氢原子被甲醛取代生成氨基酸的二羟甲基衍生物。
由于氨基上的氢被取代，氨基上氢离子的解离常数降至7左右，滴定终点pH在9左右，这样就可以用酚酞做指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定氨基上的氢离子。
此法滴定的是α-氨基的含量，准确度仅达氨基酸理论含量的90%。
二、材料仪器与试剂1、材料：白豆油或浅色饮料，色深样品需进行脱色处理2、仪器：锥形瓶、滴定管、10ml量筒和移液管，20ml量筒或移液管，100ml 容量瓶。
3、试剂：中性甲醛，酚酞指示剂（0.5%）（0.5克酚酞定容100毫升），0.01N 氢氧化钠溶液。
三、操作步骤1、制样：根据样品颜色及氨基酸含量将样品进行适当稀释，一般吸取20ml样品，稀释定容到100m l。
色泽深的样品先加入50ml水和活性炭5g，加热煮沸，过滤，用30ml水洗涤活性炭，洗涤水与滤液合并，然后转移至100ml容量瓶中定容至刻度。
固体样品需粉碎后称取5~10g，加50ml水和活性炭5g，加热煮沸，过滤，用30ml水洗涤活性炭，洗涤水与滤液合并，然后转移至100ml容量瓶中定容至刻度。
2、测定：准确吸取已稀释的样品溶液10ml于三角瓶中，加入10ml中性甲醛，滴加2~3滴酚酞指示剂，用0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定至溶液呈微红，30秒不褪色（8.2～10.0）即为终点。
3、空白滴定：用去除二氧化碳的蒸馏水替代样品进行滴定。
四、计算氨基氮（mg/ml或g样品）=[（V-V O）×C×0.14008]/10×100M或VC----氢氧化钠的当量浓度V-----滴定样品时消耗的氢氧化钠溶液的体积（ml）V O------滴定空白时消耗的氢氧化钠溶液的体积（ml）0.14008----氮的毫克当量。
氨基氮含量的测定—甲醛滴定法
氨基氮含量的测定—甲醛滴定法中性甲醛制备：量取200ml甲醛溶液至400ml烧杯中，用磁力搅拌器搅拌，边搅边用0.1mol/LNaOH溶液滴定至pH8.1。
取样品处理液1.0mL置于200mL烧杯中，加64mL去CO2水，开动磁力搅拌器，用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.2；加入20.0mL中性甲醛溶液，摇匀。
再用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积V l；取65ml水先用0.1mol／L氢氧化钠溶液调至pH 8.2，再加入20.0mL中性甲醛溶液，用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液滴定至pH 9.2，作为试剂空白试验。
按照下列公式计算：氨基酸态氮(g／L) =(V1-V0)×C×1.4/V式中：V1——测定样品加入甲醛后消耗0.1mol／L Na0H溶液的体积(m1)；V o——测定空白加入甲醛后消耗Na0H标准溶液的体积(m1)；C——标定的氢氧化钠标准溶液物质的量浓度[C(NaOH)](mol／L)；V——样品体积(m1)；0.014——C(NaOH)=lmol／L氢氧化钠标准溶液lmL相当的氮克数。
方法来自：赵新淮，冯志彪。
蛋白质水解物水解度的测定。
食品科学，1994,11公式来自：徐鑫，何佳易。
小黄鱼抗氧化肽制备条件的响应面优化。
食品科学，2011,32（21）：165—170。
标准NaOH溶液的配制：称取110克氢氧化钠，溶于100毫升去二氧化碳的水中，置于300毫升锥形瓶中，不时振荡，溶解后用橡皮塞塞紧并静置数日直到碳酸钠全部沉到底部时，倾出上面清澈液备用。
取以上氢氧化钠浓溶液5.5毫升，加水至1000毫升，混匀，制成0.1mol/l氢氧化钠溶液。
标准氢氧化钠浓溶液的标定：准确称取水解度=游离氨基酸/总氮×100﹪。
关于氨基酸的定量分析
• 再在冰浴中冷却3 min 以上,加碘化钾5mL , 立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定至淡 黄色,加入淀粉溶液2 mL ,继续滴定至蓝色 消失为终点,同时做空白试验。
x(v1 v2)c0.02403100 m 25 100
有吸收的衍生试剂。该方法的基本原理是 经阳离子交换柱分离出的氨基酸与茚三酮 混合,经加热反应后,一级胺与之生成蓝紫 色化合物,二级胺与之生成黄色化合物。两 种衍生物使用双通道紫外检测器同步检测, 检测波长分别为570nm 和436nm。
C OH
C
C
OH
O
茚三酮
O
C OH
C
C
OH
O
COOH
H 3N
C
关于氨基酸的定量分析
氨基酸的分析方法
化学分析法——甲醛滴定法 甲醛滴定法用于氨基氮的
测定, 可以测出样品中总氨基酸 的含量,其原理是在中性或弱碱 性水溶液中,氨基酸的α—氨基与醛类反应生成
Schiff碱:α—氨基酸与甲醛反应生成亚 甲基亚氨基衍生物
H
R C C O O
N H 3
H C H O
O H
H
பைடு நூலகம்
R
O
C OH
C
C
H
NH3
CO2
O
O
C OH C
C OH
O
O C
C C O
O
C
NC
H
C
O
紫色化合物
RCHO
H
O C
CN C O
亮黄色化合物
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量
甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、1%酚酞酒精溶液称1g酚酞溶于100ml 95%酒精中。
2、%溴麝香草酚蓝溶液取溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、氨基酸溶液4、标准L 氢氧化钠溶液5、中性甲醛溶液取甲醛溶液50ml，加1%酚酞指示剂2滴，滴加L NaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管3、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、操作步骤1、取3只50ml锥形瓶，按下表加入试剂。
2、混匀后用标准L氢氧化钠溶液滴定至紫色（~）3、结果计算氨基酸溶液中含氨基酸的百分比浓度为C=（V1-V2）×C0×氨基酸分子量/（10×V样）式中：C：总酸含量（g/100ml）V1为滴定样品消耗标准氢氧化钠的体积（ml）；V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）；C0：标准氢氧化钠准确浓度(mol/L)V样：样品体积(ml)4 、氢氧化钠标准溶液的标定五、注意事项（1）利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
（2）氨与甲醛反应方程①铵根与甲醛反应生成六次甲基四胺盐及强酸：（氨的部分电离产生少量铵根，但由第二个反应大量消耗铵根后，氨电离方程就强烈地偏向右边了）②反应生成的六次甲基四胺盐及3个氢离子都可以跟碱反应，而溶液中正好有还未反应的氨水，因而第二个反应，中和反应发生(CH2)6N4H+ + NH3 = (CH2)6N4 + NH4+H++NH3=NH4+这第二组反应就是一个释放出中和热的过程，所以溶液就热起来。
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量演示教学
甲醛滴定法测定溶液中的氨基酸含量甲醛滴定法测定氨基酸含量一、目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的一N+H3结合，形成一NH —CH2OH、一N（CH2—OH）2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+,测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、1%酚酞酒精溶液称1g酚酞溶于100ml 95%酒精中。
2、0.5%溴麝香草酚蓝溶液取0.5溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、氨基酸溶液4、标准0.100mol/L氢氧化钠溶液5、中性甲醛溶液取甲醛溶液50ml，加1%酚酞指示剂2滴，滴加0.1mol/L NaOH 溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管3、移液管洗耳球4天平5、容量瓶6试剂瓶7、量筒8玻棒与烧杯四、操作步骤、混匀后用标准氢氧化钠溶液滴定至紫色(pH8.7~9.0)3、结果计算氨基酸溶液中含氨基酸的百分比浓度为C= （V i-V2）x C o X氨基酸分子量/ （10W样）式中：C :总酸含量（g/100ml）V i为滴定样品消耗标准氢氧化钠的体积（ml）;V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）;C o：标准氢氧化钠准确浓度（mol/L）V样：样品体积（ml）4、氢氧化钠标准溶液的标定4 i4.1 I IK懈取1 于io®沱i' 側的水中摆匀准人聚乙娇容器中理用敖賢竜常械清益 竝1削規魚聰料骨瞬上层静厨无二砒段射解至M 伽L.舶. +X JiOS 标框炳JE 附质国戡度肌WOH ）」」（欣I;U151 0.5 27 0.15,411.2标定2于IO5C-l ：0r 电也箱中+甥至恆重的工作塞准试期菲苯二印翳勿輒削无二氫It 碳的水常解旳2掃酎散指*釈10祸）用圧制好的氢軋化的裁陵稱定至諮液30 s*同时齢白试執站：用-紳二甲卿帥质鼬IM 数似戦为克妙v的皐飮单位为毫升（讥）：亂祉畴林定尉的 载畫肌WJH ）扒泅/打T 隣踰胖一甲魅剛好邢无二 |[|1T.5so 歆3XSao __—|0J0.7550^XIOOO E 疋)M空白试期統桶辎体积脯仏戦为JHKmLh曲数仏单也为克再庫尔【”mol}[M（KHGHQ）—2必?乩五、注意事项(1) 利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
甲醛滴定法测定氨基氮
实验二甲醛滴定法测定氨基氮一、目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。
二、原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：-NH3是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定-NH3所释放的H ＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使-NH3释放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。
因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。
如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。
三、仪器、试剂、材料1.仪器25mL锥形瓶；碱式滴定管；吸管。
2.试剂（1）0.1mol/L标准甘氨酸溶液准确称取7.5g 甘氨酸，溶解后定容至1000mL。
（2）0.02mol/L标准氢氧化钠溶液（3）酚酞指示剂(0.5%酚酞乙醇溶液)：取0.5g酚酞，用95％乙醇溶解，并稀释至100mL，无需加水。
（4）400 mL中性甲醛溶液在50mL36～37％分析纯甲醛溶液中加入1mL0.5％酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
四、操作方法1.氢氧化钠溶液标定（1）准确称取0.08g邻苯二甲酸氢钾；（2）用量筒准确量取50mL纯净水，溶解完全；（3）加入2滴酚酞指示剂，（4）用氢氧化钠溶液滴定，记录体积；平行做2次。
（5）求消耗氢氧化钠溶液平均值，用公式计算氢氧化钠溶液浓度。
2.取3个25mL的锥形瓶，编号。
向1、2号瓶内各加入0.05mol/L标准甘氨酸溶液2mL和水5mL，混匀。
向3号瓶内加入7mL水。
然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液再混匀，分别用0.02mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
甲醛滴定法测定氨基氮
甲醛滴定法测定氨基酸含量一、实验目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点二、实验原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。
若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。
脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
三、实验仪器与设备（一）试剂1、0.5%酚酞酒精溶液称0.5g酚酞溶于100ml60%酒精中。
2、0.05%溴麝香草酚蓝溶液取0.05溴麝行草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。
3、1%甘氨酸溶液取1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。
4、标准0.100mol/L 氢氧化钠溶液5、中性甲本醛溶液取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/LnaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。
（二）实验器具1、锥形瓶2、碱式滴定管1、移液管洗耳球4、天平5、容量瓶6、试剂瓶7、量筒8、玻棒与烧杯四、实验步骤1、取3只100ml 锥形瓶，按下表加入试剂。
2、混匀后用标准0.100mol/L 氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH8.7~9.0）3、结果计算每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为12() 1.40082V V mg -⨯= 式中：V 1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml ）；V 2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml ）；1.4008 为1ml 0.1mol/L 氢氧化溶液相当的氮量（mg ）五、注意事项利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。
随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
氨基态氮的测定
1、双指示甲醛滴定法
（1）原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。
它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。
当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。
这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。
（2）方法特点及应用此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。
在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。
普氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;溶液中若有存在也可与甲醛反应，往往使结果高。
（3）试剂①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。
②0.1%百里酚酞乙醇溶液③0.1%中性红50%乙醇溶液④0.1%mol/L氢氧化钠标准溶液
（4）操作步骤
1）含氨基酸溶液20-30mg→250ml锥形瓶中→中性红指示剂2-3滴，滴0.01mol/lNAOH 滴定终点（红→琥珀色）
2）含氨基酸溶液20-30mg→250ml锥形瓶中→百里红酚酞3滴/中性甲醛20ml→摇匀，滴0.01mol/lNAOH滴定终点（淡蓝色）
3）分别记录两次消耗碱液的用量
（5）结果计算
氨基酸态氮% ＝（v2-v1）*c*0.014/m*100
式中:
c----氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L
V1----中性红指示剂滴定时消耗NaOH标准溶液体积，mL
V2----百里酚酞知己滴定是消耗NaOH标准溶液体积，mL
m-----测定用试样溶液相当于试样的质量，g
0.014----氮的毫摩尔质量，g/mmol。
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实验二甲醛滴定法测定氨基氮
一、目的
初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。
二、原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：
-NH3是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定-NH3所释放的H＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使-NH3释放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。
因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。
如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。
三、仪器、试剂、材料
1.仪器
25mL锥形瓶；碱式滴定管；吸管。
2.试剂
（1）0.1mol/L标准甘氨酸溶液
准确称取7.5g 甘氨酸，溶解后定容至1000mL。
（2）0.02mol/L标准氢氧化钠溶液
（3）酚酞指示剂(0.5%酚酞乙醇溶液)：
取0.5g酚酞，用95％乙醇溶解，并稀释至 100mL，无需加水。
（4）400 mL中性甲醛溶液
在50mL36～37％分析纯甲醛溶液中加入1mL0.5％酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
四、操作方法
1.氢氧化钠溶液标定
（1）准确称取0.08g邻苯二甲酸氢钾；
（2）用量筒准确量取50mL纯净水，溶解完全；
（3）加入2滴酚酞指示剂，
（4）用氢氧化钠溶液滴定，记录体积；平行做2次。
（5）求消耗氢氧化钠溶液平均值，用公式计算氢氧化钠溶液浓度。
2.取3个25mL的锥形瓶，编号。
向1、2号瓶内各加入0.05mol/L标准甘氨酸溶液2mL和水5mL，混匀。
向3号瓶内加入7mL水。
然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液再混匀，分别用0.02mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。
取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。
3.取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。
计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。
五、结果处理
1.氢氧化钠溶液标定
C NaOH=m/(G邻*V)
注解：m：g；
G邻：204.2；
V：ml
2.回收率计算：
甘氨酸氨基氮回收率％＝实际测得量
×100 加入理论量
公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。
3.氨基氮计算：
氨基氮（毫克/毫升）= （V未－V对）×N NaOH×14.008
2
公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。
V对为滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。
N NaOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。
六、注意事项
1.标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。
不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。
2.中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。
3.本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学要求进行。
4.脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。
而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。
七、思考题
甲醛滴定法为什么不能准确测定含有多种氨基酸的样品中的氨基氮？。