生物固氮及其发展前景

生物固氮及其发展前景摘要：本论文主要介绍生物固氮概念、固氮微生物及其种类和生物固氮发展前景。

关键词：生物固氮固氮微生物固氮生化机制生物固氮展望引言：生物固氮是一个具有重大理论意义和实用价值的生化过程。

生物固氮反应是一种及其温和及零污染排放的生化反应，它比人类发明的化学固氮有这无比的优越性，因后者需要消耗大量的石油原料和特殊的催化剂，并须要在高温（~300℃）、高压（~300个大气压）下进行。

此外，若不合理地使用氮肥，还会降低农产品的质量，破坏土壤结构和降低肥力，以及造成坏境污染（如湖泊的水华和海洋的赤潮）等恶果。

我国在近半个世纪当中，化肥产量猛增近6000倍，其有害影响已不断出现。

因此，我们应深刻认识到，只有深入研究、开发和利用固氮微生物，才能更好的发展生态农业和达到土地可持续利用的战略目标。

如果把光合作用旱作是地球上最重要的生化反应，则生物固氮作用便是地球上仅次于光合作用的生物化学反应，因为它为整个生物圈中一切生物的生存和繁荣发展提供了不可或缺和可持续供应的还原态氮化物的源泉。

内容：⒈生物固氮定义：指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催化而还原成氨的过程，生物界中只有原核生物才具有固氮能力。

⒉固氮微生物的种类⒉1 自生固氮菌⒉⒈1好氧：化能异养、化能自养、光能自养⒉⒈2兼性厌氧：化能异养、光能异样⒉⒈3厌氧：化能异养、光能自养⒉2 共生固氮菌⒉⒉1根瘤：豆科植物、非豆科被子植物⒉⒉2植物：地衣、满江红⒉3 联合固氮菌⒉⒊1根际（热带、温带）⒉⒊2叶面⒉⒊3动物肠道⒊固氮的生化机制⒊1生物固氮反应的6要素⒊⒈1ATP的供应由于N≡N分子中存在3个共价键，故要把这种极端的分子打开就得花费巨大能量。

固氮过程中把N2还原成2NH3时消耗的大量ATP(N2:ATP=1:(18~24)是由呼吸、厌氧呼吸、发酵或光合磷酸化作用提供的。

⒊⒈2还原力[H]及其传递载体固氮反应中所需大量的还原力（N2︰[H]=1︰8)必须以NAD（Ｐ）Ｈ＋Ｈ﹢的形成提供。

[Ｈ]由低电势的电子载体铁氧还蛋白(ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ，一种硫铁蛋白)或黄素氧还蛋白（Ｆｌｄ，一种黄素蛋白）传递至固氮酶上。

⒊⒈３固氮酶固氮酶是一种复合蛋白，由固二氮酶还原酶两种相互分离的蛋白构成，它们对氧都高度敏感。

固二氮酶是一种含铁和钼的蛋白，铁和钼组成一个称为“ＦｅＭｏＣｏ”的辅助因子，它是还原Ｎ２的活性中心。

而固二氮酶还原酶则是只含铁的蛋白。

某些固氮菌处于不同生长条件下时，还可合成其他不含钼的固氮酶，称为“替补固氮酶”，具有适应极度缺钼环境下还能正常进行生物固氮的功能。

⒊⒈4还原底物－－N2.⒊⒈5镁离子⒊⒈6严格的厌氧微环境。

⒊2测定固氮酶活力的乙炔还原法测定固氮酶活力的经典方法曾有过粗放的微量氏定氮法和烦琐的同位素法等。

1996年，M.J.Dilworth和R.Scholhorn等人分别发表了既灵敏又简单的利用气相色谱仪测定固氮酶活性的乙炔还原法，大大推动了固氮生化的研究。

已知固氮生化除了能催化N2→NH3的反应，还可能催化许多反应，包括2H﹢+2e﹣→H2和C2H2→C2H4等反应，在后一反应中，这两种气体量的微小变化也能用气相色谱仪检测出来。

测定时，只要把带测测细菌制成悬浮液，放在含有10%C2H2空气（对好氧菌）或C2H2的氮气（对厌氧菌）的密闭容器中，经适当培养后，按不同时间用针筒抽取少量的气体至气相色谱仪测定，即可获得是否固氮及固氮强度等准确数据。

由于乙炔还原法的灵敏高度、设备较简单、成本低廉和操作方便，故很快成为任何研究固氮实验室中的常规方法。

⒊3固氮的生化途径目前所知道的生物固氮的总反应是：N2+8[H]+16~24ATP→2NH3+H2+16~24ADP+16~24Pi整个固氮过程主要经历以下几个环节：①由Fd或Fld向氧化型固二氮酶还原酶的铁原子提供一个电子，使其还原；②还原型的固二氮酶还原酶与ATP﹣Mg结合，改变了构象；③固二氮酶在“FeMoCo”的Mo位点上与分子氮结合，并与固二氮酶还原酶﹣Mg﹣ATP复合物反应，形成了一个1:1复合物，即完整的固氮酶；④在固氮酶分子上，有一个电子从固氮酶还原酶﹣Mg﹣ATP复合物转移到固氮酶的铁原子上，这时固氮酶还原酶重新转变为氧化态，同时ATP也就水解成ADP＋Pi；⑤通过上述过程连续6次（用打点子的箭头表示）的运转，才可使固二氮酶释放2个NH3分子；⑥还原一个N2分子，理论上仅需6个电子，而实际测定却需8个电子，其中2个消耗在产H2。

必须强调指出的是，上述一切生化反应都必须受活细胞中各种“氧障”的严密保护，以保证固氮酶免受失活。

⒊4固氮酶的产氢反应固氮酶除能催化N2→NH3外，还具有催化2H﹢＋2e﹣→H2反应的氢化酶的活性。

当固氮菌在缺N2环境下，也只是把75%的还原力[H]去还原N2，而把另外25%的[H]以产H2的方式浪费掉了。

然而，在大多数固氮菌中，还存在另一种经典的氧化酶，它能将被固氮菌浪费了的分子氢重新激活，以回收一部分还原力[H]和ATP。

⒋生物固氮的应用及其前景大气中的氮，必须通过以生物固氮为主的固氮作用，才能被植物吸收利用。

动物直接或间接地以植物为食物。

动物体内的一部分蛋白质在分解过程中产生的尿素等含氮废物，以及动植物遗体中的含氮物质，被土壤中的微生物分解后形成氨，氨经过土壤中的硝化细菌的作用，最终转化成硝酸盐，硝酸盐可以被植物吸收利用。

在氧气不足的情况下，土壤中的另一些细菌可以将硝酸盐转化成亚硝酸盐并最终转化成氮气，氮气则返回到大气中。

除了生物固氮以外，生产氮素化肥的工厂以及闪电等也可以固氮，但是，同生物固氮相比，它们所固定的氮素数量很少。

可见，生物固氮在自然界氮循环中具有十分重要的作用。

⒋1农业应用生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用。

氮素是农作物从土壤中吸收的一种大量元素，土壤每年因此要失去大量的氮素。

如果土壤每年得不到足够的氮素以弥补损失，土壤的含氮量就会下降。

土壤可以通过两条途径获得氮素：一条是含氮肥料（包括氮素化肥和各种农家肥料）的施用；另一条是生物固氮。

科学家在20世纪80年代推算过，全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大约有8*10^7t，而自然界每年通过生物固氮所提供的氮素，则高达4*10^8t。

对豆科作物进行根瘤菌拌种，是提高豆科作物产量的一项有效措施。

播种前，将豆科作物的种子沾上与该种豆科作物相适应的根瘤菌，这显然有利于该种豆科作物结瘤固氮。

特别是新开垦的农田和未种植过豆科作物的土壤中，根瘤菌很少，并且常常不能使豆科作物结瘤固氮，更需要进行根瘤菌拌种。

对比实验表明，在其他条件相同的情况下，经过根瘤菌拌种的豆科作物，可以增产10%～20%。

⒋2研究简况1886年在第59届德国科学家和医生学术讨论会上，德国学者赫尔利格尔(Hermann Hellriegel）首次提出令人惊奇的试验结果，即当大豆生长在缺氮的土壤中时，大豆的根瘤也能使其良好生长，其机理在于其根瘤具有固氮功能。

在当时称之为根生杆菌，现在称之为大豆根瘤菌的细菌对豆科植物根部的根瘤形成具有特殊的刺激作用。

在根瘤菌内，根瘤菌将大气中的氮还原为能被植物吸收利用的氨，豆科宿主在吸收了这些氨之后又能将其转变为含氮有机化合物，以供其生长发育之需。

通过对根瘤菌进行接种培养后于1895年就获得了具有很强固氮能力的根瘤菌菌种。

通过添加灭菌草木灰等吸附剂之后，大批根瘤菌被施用到三叶草、豌豆和小扁豆等豆科作物的种植地中以提高其产量。

现在已经知道，在自然界具有固氮功能的生物种类很多，其中有自养固氮生物和异养固氮生物这两大类型。

在异养固氮生物中因宿主植物的差异而被划分为豆科植物共生固氮菌和非豆科植物共生固氮菌。

尽管固氮生物多种多样，但在其固氮过程中都需要共同的固氮基因（nif）的参与。

在共生固氮生物中固氮体系非常复杂，除了nif基因在固氮过程中起关键性作用之外，其它基因的协同作用也非常重要。

由于根瘤菌具有的特殊功能，大批热心的研究者对其特征特性，对寄主的侵染方式、固氮机制和商业价值等进行了系统的研究。

本世纪80年代以来，学者们一方面从分子水平进一步研究根瘤菌在豆科植物上的固氮机理和改造根瘤菌，试图培育出活性更强的根瘤菌；另一方面利用人工诱导方式诱发非豆科作物根部结瘤，试图利用根瘤菌的特殊功能使非豆科作物也能共生固氮，以便减少农田中氮肥的施用量，降低农作物的生产成本。

除此之外，在70年代末，由于在放线菌中发现了弗兰克氏菌（Frankia）与多种非豆科树木能共生结瘤并具有固氮效应，因而在生物固氮研究中又产生了一个新的分支，即以研究弗兰克氏菌的分类、功能、分布和应用前景为主要内容的新领域。

从现有的研究结果来看，与豆科植物的根瘤菌的固氮体系相比，利用弗兰克氏菌具有广谱侵染的特性，对建立新的固氮技术体系可能具有更大的意义，应用前景更广阔。

⒋3展望据测算，在大气中氮素含量为3.9×1015吨；在全球耕地内生物固氮量理论上可达到4400万吨，约相当于全世界每年生产的化肥总量；全球林地面积约为4.1亿公顷，其固氮总量可达到4000万吨。

由于在氮素化肥生产中伴随着能源耗费和日趋严重的环境污染问题，人们逐渐认识到农林业生产完全依赖化肥终非良策，于是，生物固氮研究日益受到各国政府的重视。

通过适当方式固定大气中的游离氮素，将其转变为能参与生物体新陈代谢的氨态氮是地球上维持生产力的一个重要的生态反应。

从战略上来考虑，正确的农业生产政策应该是既要增加粮食生产，又不要损害土地的持久生产力，而生物固氮正好能同时满足这两个目的。

应用现代科学技术建立和完善生物固氮体系已经成为解决人类目前所面临的人口、粮食、能源和环境等问题的重要技术措施。

近20年来生物固氮已经成为一个多学科的综合性研究项目，分别在分子、细胞、个体和生态等多层次水平上，从微观到宏观不断地展开着探索性研究。

从目前的研究现状来看，试图通过基因工程将nif 基因从豆科植物转移到非豆科农作物中难度比较大，在短期内很难实现，而采用细胞工程方法将根瘤菌导入非宿主农作物细胞内则切实可行。

除此之外，由于Frankia菌具有对宿主的侵染范围宽、固氮活性比较强和对氧气不敏感等特性，在生物固氮研究中对Frankia菌的研究将更为重要，有可能由此会找到新的突破口。

在Frankia菌与农作物之间建立起新的共生固氮体系将具有更大的可能性。

这项研究已呈现出新的苗头，值得进一步探索。

生物固氮研究已经引起越来越多的人的关注。

在这方面的研究今后主要包括基础理论和应用基础这两个方面。

在基础理论研究中主要围绕着诱发非豆科作物结瘤的最佳条件和提高共生固氮效能，其中包括诱导根瘤菌侵入主要农作物共生结瘤的有效方法；提高非豆科农作物共生结瘤固氮的效能；根瘤菌导入非豆科宿主细胞的途径、共生部位和共生机理；采用适当的技术措施诱导Frankia菌与主要农作物结瘤固氮；Frankia菌共生结瘤固氮的机理等等。