宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准
简介：
宏基因组测序介绍
宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。

随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。

高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。

可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。

目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。

下面就是对这两者的具体介绍。

一、16s DNA/18s DNA/ITS测序
16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。

目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。

因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。

二、宏基因组全测序
在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。

这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。

可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。

此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。

样品处理：
宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。

样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。

尽量留足备份样品。

核酸提取：
宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。

对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。

核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。

测序Sequencing
1)16S/18S测序：
Sanger测序：
用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。

由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。

454 Platform：
454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。

454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。

文库构建：
用fusion Primer扩增核糖体RNA，将已扩增的rRNA直接做乳液PCR，在GS FLX+ 和GS Junior系统上进行测序。

测序深度：
数据分析：
使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。

1.MEGAN：一个宏基因组分析工具，可以在大量的测序数据中对测序结果进行
聚类分析。

2.MG-RAST：用于注释宏基因组样品的全自动软件。

3.IMG/M：基于宏基因组序列微生物群体的功能性。

4.CAMERA：致力于微生物生态学研究。

5.CARMA：可以通过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗传潜力的研究。

6.GALAXY：用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。

7.Greengenes：16S rRNA的数据库，可以用来做16S rRNA的比对。

8.QIIME：针对454测序数据的宏基因组分析。

9.The Ribosome Database Project（RDP）：针对焦磷酸测序的分析方法。

Miseq Platform：
Miseq平台读长可以是2X250bp或2X300bp。

使用Miseq Reagent Kit V2
可以产出的数据，使用Miseq Reagent Kit V3可以产出的数据。

文库构建：
根据感兴趣的片段设计引物，通过PCR扩增出片段做为模板构建文库。

使用Nextera XT Sample Prep Kit构建文库，按照试剂盒说明书操作。

将建好的文库归一化处理并将其混到一起。

在Miseq系统里自动进行成簇反应，进而完成测序。

文库检验：
用Agilent 2100检测文库大小片段是否与预期一致。

文库片段是否集中。

测序深度：
16S rRNA测序深度应至少在50,000条reads以上，以保证较好的覆盖度。

数据分析：
对微生物生态进行定量观察
Greengenes：16S rRNA基因数据库和分析工具；
宏基因组分析工具：MEGAN
核糖体数据库计划(RDP)
Ion Torrent Platform：
Ion Torrent平台主要有两个测序系统：Ion PGM System和Ion Proton System。

Ion PGM有两种读长，200bp和400bp，Ion PGM主要应用三种芯片，Ion 314 Chip，Ion 316 Chip和Ion 318 Chip，最多数据产出可以达到2Gb。

Ion Proton 读长为200bp，最多数据产出可达到10Gb。

文库构建：
使用Ion Plus Fragment Library Kit为16S rRNA扩增产物加上barcode 标签，一共有96个barcode可以选择。

加上标签后使用Ion PGM™ Template OT2 200 Kit在Ion OneTouch™ DL System上进行乳液PCR，完成文库构建。

测序时根据需要不同的读长选择不同的测序试剂盒。

测序深度：
对于人体肠道微生物16S rRNA测序，对于检测高丰度的样品，每个样品至少要测10000条reads，而对于检测低丰度的样品，则需要1,000,000以上的reads数。

2)全宏基因组测序Whole-metagenomics Sequencing Roche 454 platform:
文库构建：
提取宏基因组DNA，总量不低于10ug，且样品DNA应相对完整。

使用GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit构建文库，按照说明书进行相应操作。

文库检验：
DNA reads数与微球的比例在8%左右，可以达到比较理想的测序结果。

测序深度：
每个样品应至少保证10,000条以上的reads数。

Hiseq platform:
Hiseq平台主要有Hiseq 2000和Hiseq 2500两个测序系统。

Hiseq 2000测序读长是2X100bp Paired-end测序，一次运行通量可达600Gb以上，Hiseq 2500
有两种运行模式：快速运行和高通量，快速运行可以达到2X150bp，产生最多180Gb的数据，高通量读长在2X125bp，数据产出在600Gb以上。

文库构建：
将提取的宏基因组DNA用Covaris M220片段化后，使用Truseq DNA XT/LT Sample Prep Kit (illumina)按照protocol进行文库构建，DNA起始投入量应在1ug以上。

文库检验：
将建好的宏基因组文库使用KAPA SYBR FAST ABI Prism 2X qPCR Master Mix (KAPA Biosystems) 试剂盒，利用ABI 7500荧光定量PCR仪，测定文库的浓度。

文库的浓度必须大于2nM。

使用DNA 1000分析试剂（Agilent），利用Agilent 2100生物分析仪分析文库的片段长度范围和质量。

文库片段的大小范围在目的大小区间内且相对集中。

测序深度：
每个样品应至少测3,100,000条reads以保证比较好的覆盖度。