基于reads宏基因组测序分析报告解读
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
全基因组测序的数据分析和生物学解读
全基因组测序的数据分析和生物学解读随着生物学的不断发展，全基因组测序已经成为了一项非常重要的技术。
基因组是细胞中存储着信息的重要组成部分，它所包含的信息能够指导生命体的生长、发育和适应环境的能力。
基因组测序就是通过对生物体DNA的高通量测序，获得它们的基因组序列信息。
全基因组测序的数据分析和生物学解读则是对产生的海量数据进行精细化处理和解读的步骤。
全基因组测序的数据分析步骤可以大致分为预处理、序列比对和变异鉴定三个部分。
预处理预处理是指对测序数据进行质量控制、去除污染和过滤低质量序列的过程。
前期质控可以通过FastQC等软件进行评估，检查数据中是否存在低质量序列、接头污染、含有接头的剪切等情况。
一旦存在这些情况，我们可以通过Trim Galore!、Fastp等软件进行过滤和去除。
而低质量序列过滤常常是基于读长、GC含量、质量分数等指标进行判断和筛选。
这些步骤都是为了保障后续分析的准确性。
序列比对序列比对是指将测序得到的reads进行比对，并确定它们在参考基因组上的位置。
由于基因组大小不一，测序技术的限制等原因，大多数应用都选择了将reads 比对到参考基因组（reference-based）上进行分析。
这个过程能够帮我们寻找到与参考序列对应的单条或多条读取序列，为后续进行基因注释、突变检测等分析提供依据。
变异鉴定变异鉴定是指利用序列比对的结果来查找基因组间的变异，并将它们分为基因缺失、突变、插入等。
常用的工具包括GATK、SAMtools、FreeBayes等。
这些工具可以有效地识别变异，比如SNP(单核苷酸多态性)和InDel(插入/删除)，并进行标注、分类、统计和过滤等等。
数据分析过程蕴含着诸多的技术和细节，这里我们介绍了其中三个部分，旨在提供一个基本框架和流程。
全基因组测序的生物学意义意义非凡，它不仅可以帮助研究人员更好的理解生命的本质，还可以有助于开发新药物、治疗方法等等。
比如对于基因突变、癌症等人类疾病研究，全基因组测序都起着极为重要的作用。
宏基因组项目报告
宏基因组项目报告一、引言宏基因组研究是一种利用高通量测序技术对不同环境中微生物的DNA进行直接测序，从而获得未经培养的微生物群落的全基因组信息的研究方法。
宏基因组项目旨在揭示细菌、真菌等微生物群落的复杂性和多样性，以及它们在各种环境中的功能特征，为人类提供更多关于微生物界的了解和应用。
二、项目设计本次宏基因组项目选择了一个自然河流水样品和一个土壤样品作为研究对象，采用Illumina HiSeq平台进行测序。
首先，对样品进行DNA提取，并进行多次PCR扩增，得到足够的片段数目进行测序。
然后，对测序得到的片段进行质量控制和去除低质量序列、接头序列和宿主DNA。
之后，使用比对软件将高质量测序读序比对到相关数据库，如NR、Kegg等，分析序列的生物学功能、多样性等。
三、结果分析1.宏基因组的物种多样性分析通过序列比对和分类，我们发现水样品中含有大量的细菌，真菌和病毒等微生物，其中以细菌为主要成分。
而土壤样品中细菌的数量明显高于真菌和病毒。
此外，从解析结果中，我们还发现了一些未知物种，这些物种可能是新的微生物，为我们探索未知微生物的多样性提供了线索。
2.宏基因组的功能分析通过对序列的注释和比对，我们可以了解微生物群落的功能特征。
我们利用Kegg数据库进行宏基因组的功能注释和代谢通路分析，发现了许多参与碳、氮、磷循环等重要代谢通路的微生物，并对其基因编码产物进行分析和功能预测。
此外，我们还发现了一些与环境适应性和生存竞争力相关的基因。
3.宏基因组的群落结构分析通过对序列的分析，我们还可以了解微生物群落的结构特征。
我们使用OTU(Operational Taxonomic Unit)对宏基因组的群落结构进行了描述和分析，发现了丰度较高的菌群，并推断其在不同环境中的生态角色和相互之间的相互作用。
此外，通过构建菌群之间的共生和拮抗网络，我们可以了解不同微生物之间的互动关系，从而进一步探究宏基因组在生态系统中的功能和影响。
病毒宏基因组测序
No. of samples
6 Eukaryotic RNA viruses 4 2 0
EnPtearroeTvcoihrbuoasvmiruSosavpiCMrouaavsrmmiruoasUvstinrUruoNcnslvoacilrsraPuoss.osvsCit.rehuPxrsivyciosroubvsirirnuasvirus
40
Eukaryotic DNA viruses
No. of samples
30
20
10
0
Unclass. ABneeAtallloptovhriarqiGtduoaaermeqviumrueCUasviMtrinrocucaorlssqvatuisarseud.vseCinriurocsvoivruiBrBsaiedbgaueoUvminruocGslvaMyiUsrrusoan.ssvcPtilrroaNueslvsyasion.ruGmosveaimBrvuoiirsncidaivapierairdvaoevirus
病毒宏基因组测序又称宏病毒组（Virome），是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。宏
病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具 有重要作用。
技术参数适用范围 样品要求 类型 测序策略与深度基于序列的病毒分类单元相对丰度左和全部样本中有尾目噬菌体和小噬菌体科相对丰度相关性比较右rna病毒物种与样本数之间对应关系左和ddna病毒物种与样本数之间对应关系右020406081002040608100204060810caudovirales00001householdcontrolsulcerativecolitiscrohn?sdisease10203040eukaryoticdnaviruseseukaryoticrnaviruses集数据库比对基于reads的整合注释多样本标准分析主成分分析聚类分析显著性差异分析
宏基因组检测技术与病原体检测结果解读分析
宏基因组检测技术与病原体检测结果解读分析作者：王珺刘超⽯瑛琪单位：杭州杰毅⽣物技术有限公司在临床医疗实践中，及时准确发现病原体对于感染性疾病诊疗意义重⼤。
传统微⽣物学检验技术，诸如培养、⽣化鉴定等⽅法在厌氧、苛养微⽣物上存在较⼤局限性；⽽免疫，荧光PCR等靶向检测难以⼴泛覆盖临床可能的病原微⽣物，尤其是罕见、新发病原体。
病原宏基因组检测(metagenomics next generation sequencing, mNGS)通过对临床样本中提取的总核酸进⾏⽆偏倚的鸟枪法测序，测序结果⾸先过滤⼈源序列，再和已知的微⽣物基因组数据库进⾏⽐对，汇报样本中的微⽣物属种和序列数（最佳⽐对或严格⽐对到某微⽣物属/种的核酸⽚段数）。
2014年，加州⼤学旧⾦⼭分校（UCSF）的Charles Chiu团队⾸次采⽤⾼通量测序技术（NGS，Next Generation Sequencing）成功地对⼀位患有联合免疫缺陷综合征，由钩端螺旋体引起脑膜炎的临床患者提供病原学诊断和治疗[1]，随后，针对病原微⽣物的metagenomic Next Generation Sequencing（mNGS）检测技术逐渐在临床⼴泛应⽤，尤其是针对免疫抑制感染患者的诊断[2]。
因为mNGS的⽆偏倚特性，理论上样本中所有微⽣物的核酸都可以检测，因此mNGS可以实现⼀万种以上病原微⽣物（细菌、病毒、真菌、寄⽣⾍）的鉴定，具有常规靶向病原学检测（微⽣物培养、抗体/抗原、PCR）所不具备的⼴覆盖优点。
但正是由于这种特点，在样本采集、运输、湿实验等过程中引⼊的外源微⽣物或其核酸的污染（exogenous microbial contamination）会对mNGS报告和解读造成⼲扰。
即便采⽤规范化的全流程⽆菌操作（⽆活体微⽣物），外源微⽣物的核酸污染依然存在[3]。
此外，⼈体开放性部位的标本（⽐如⼝咽拭⼦、痰液、肛周拭⼦等）中往往存在⼤量条件致病微⽣物的定植和共⽣，如何对微⽣物的定植和感染进⾏判别，从⽽明确责任病原体，是mNGS结果解读中需要注意的另⼀个重要问题[4]。
宏基因检测结果简要解读
宏基因检测结果简要解读病原学的精准诊断对于感染性疾病的诊断和治疗具有重要意义。
传统的病原学诊断高度依赖于临床医师的经验，通常根据患者的临床表现做出病原体的鉴别诊断，针对可疑的病原体进行检测，逐一排查；因传统检测方法的局限性往往无法兼顾罕见致病病原体和混合感染等情况，而宏基因组第二代测序(metagenomics next generation sequencing，简称mNGS)技术可以快速、无偏倚地同时检测多种病原体。
mNGS正愈加普遍地应用于临床感染性疾病病原检测，成为助力疑难、危重感染诊断的好帮手，但是很多临床医生对报告单的结果解释有所疑惑，因此本文针对目前本中心提供的病原微生物宏基因检测项目报告单的结果部分做出一些说明。
病原微生物宏基因检测结果包括如下几个部分：1.细菌列表；2.真菌列表；3.病毒列表；4.寄生虫列表；5.1 结核分枝杆菌复合群列表；5.2 非结核分枝杆菌（NTM）列表；5.3 支原体/衣原体列表；6.耐药基因列表；7.疑似背景列表。
列表中会报告检测到微生物所属的属的中文名、拉丁文名、序列数和相对丰度以及种的中文名、拉丁文名、序列数、相对丰度和基因组覆盖度，针对细菌和病毒还会提供其所属类型，如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、DNA病毒、RNA病毒等。
其中，序列数是指能够特异性比对到该病原体的碱基序列数目，宏基因技术是把微生物的核酸打断成核酸片段后进行测序，换句话说，序列数就是检测到多少个核酸片段属于该微生物，因此序列数往往与该病原体的载量正相关。
相对丰度是指该病原体在检测到的同类微生物中的序列占比，由于细菌、真菌、病毒和寄生虫的微生态特征、临床意义不同，它们是独立计算相对丰度的，例如，某个细菌的相对丰度是该细菌在该样本所有检出细菌中所占的百分比。
因此相对丰度越高，表示该病原体在标本中的占比越高，但不同大类间的微生物相对丰度无法互相比较。
基因组覆盖度是指该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值，基因组覆盖度与序列数有关，序列数越多，核酸越高，表示该病原体在标本中真实存在的可性能越高。
宏基因组测序讲解
或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组细菌多样性。如宏基因组
并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般
DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]equence based screening)两种方法。
宏基因组学的研究步骤
一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到
蛋白等的试剂盒，在食品工业、NA构建
模式微生物并不能把所
DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率
从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提
但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论
DNA提取方法的改进[68]。
(细胞提取法)。直接裂解法是将
继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、
)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、
但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以
DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，
DNA。此法可获得大片段
4个步骤。特别要指出的是，在基
其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因
(community)的混合基因组序
这种差别的关键就பைடு நூலகம்，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材
分离特定环境生物DNA
DNA的做法，而是首先直接收集能
然后利用各种理化方法破碎微生物，使
DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
基于二代测序技术的宏基因组学分析
基于二代测序技术的宏基因组学分析宏基因组学是一门研究微生物群落的遗传多样性和功能的学科。
随着高通量测序技术的快速发展和应用，二代测序技术如Illumina公司的MiSeq和HiSeq平台已经成为宏基因组学研究中最常用的方法之一、本文将介绍基于二代测序技术的宏基因组学分析的工作流程和一些常用的分析方法。
首先，宏基因组学研究的核心是从环境样品中提取DNA，并进行PCR扩增来构建测序文库。
在这一步骤中，研究者需要设计适当的引物来扩增感兴趣的基因序列，例如16SrRNA基因用于细菌和古菌的研究，ITS区域用于真菌研究，或者全基因组扩增用于功能基因的分析。
提取到的DNA样品会经过质量检测和浓缩后，用PCR方法扩增目标基因序列或整个基因组。
提取到的DNA样品经过扩增后，可以进行两种主要的二代测序方法，即全基因组测序和目标基因测序。
全基因组测序是对DNA样品进行整个基因组的测序，可以获得更全面的基因组信息，但由于数据量大，需要更高的测序成本和计算资源。
另一种是目标基因测序，主要针对特定的基因序列进行测序，数据量较小，更适合于大规模的样品处理。
得到测序结果后，需要对测序数据进行质控处理，包括去除引物序列、质量剪切、去除低质量的reads等等。
然后，将高质量的reads进行序列比对、细菌分类和功能注释等分析。
常用的宏基因组学分析软件包括QIIME、Mothur和MG-RAST等。
在分析中，最常用的方法是对16S rRNA基因进行分类和定量分析。
通过比对测序reads和数据库中的已知序列，可以获得样品中细菌和古菌的组成。
此外，也可以通过测序数据进行基因丰度分析，以了解样品中各个基因的相对丰度。
除了基因组组成分析，宏基因组学也可以用于功能基因的研究。
通过对测序数据进行功能注释，可以了解样品中不同基因的功能。
通常，会将测序reads比对到已知的功能基因数据库，如KEGG、COG和GO等，获得基因功能分类和丰度信息。
此外，基于二代测序技术的宏基因组学还可以进行微生物群落的多样性分析。
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五、功能数据库注释——基于reads的功能分析基本步骤
基于reads的功能分析基本步骤: 1）使用HUMAnN2软件（2018年发表在Nature methods），将质控和去宿主之 后的序列与蛋白质数据库（UniRef90）进行比对（基于DIAMOND）； 2）过滤掉比对失败的reads； 3）统计UniRef90各个蛋白的相对丰度（RPKM ，reads per kilobase per million），校正样本比对成功reads(mapped reads)数以及基因长度后的丰度。 4）根据UniRef90 的ID 和各个功能数据库ID的对应关系（主要来自LinkDB），统 计各个功能数据库对应功能相对丰度。 5）从各个数据库功能的相对丰度表出发，进行相对丰度柱形图展示，Circos图展 示，丰度聚类热图展示，组间功能差异LEfSe分析，组间功能差异pair-wise多重比 较DunnTest分析，显著差异功能物种来源柱形图分析，KEGG通路图填色，功能 与环境因子（或者其它组学数据）的相关性分析。
专注微生态
2020.09.14
Ø项目概述
目
Ø项Hale Waihona Puke 流程录Ø测序数据处理
Ø物种注释
Ø功能注释
Ø抗性基因注释
Ø相关性分析
2
一、项目概述
近年来，环境和生物体相互作用的微生物群体逐渐成为新兴的研究热点， 而大量复杂的微生物群体存在培养困难，构成复杂（包括细菌、古菌、真菌、 原生生物、病毒甚至小型真核生物）。因此如何用高通量精准的了解这些群体 的构成，基因功能分布以及具体的表达活性和代谢状况成为首要问题。
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四、物种注释——共有物种分析
根据物种是否存在来寻找分组之间的特有或共有的物种，对于分组较少（小 于等于5）的实验方案，绘制韦恩图（Venn diagram）分析不同样品组之间特有 或共有的物种（种水平），用于统计多个样本中所共有和独有的物种数目，可以 直观表现样本分组间物种组成相似性及重叠情况（图4-5）。对于分组较多的 （大于等于3），绘制了花瓣图。
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四、物种注释——LEfSe差异分析
LEfSe寻找每一个分组的特征微生物（默认为LDA>2的微生物），也就是 相对于其他分组，在这个组中丰度较高的微生物（ Phylum水平）。
每一横向柱形体代表一个物种，柱形体的长度对应LDA值，LDA值越高则 差异越大。柱形的颜色对应该物种是那个分组的特征微生物（在对应分组中的 丰度相对较高）。
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三、测序数据处理——序列质控和去宿主序列
测序获得的原始数据（Raw Data）中存在一定比例低质量数据。为了保 证后续分析结果的准确性和可靠性，需要根据碱基的质量信息对原始数据进行 序列质控和去宿主序列处理，获取用于后续分析的有效序列（clean data） 。 1.使用Cutadapt去除测序接头序列：
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五、功能数据库注释
Ø①样品组成概况
——Pathway相对丰度柱形图
Ø②区分多组样品的Biomarker ——LEfSe差异分析LDA柱形图
Ø③功能物种来源分析
——物种来源组成柱形图
Ø④考察不同样品或者分组间的相似或差异性——聚类热图
Ø⑤展示每个样本中Pathway的丰度、各个Pathway分别在各个样本中
多维数据进行降维，从而提取出数据中最主要的元素和结构；PCA 能够提取
出最大程度反映样品间差异的两个坐标轴，从而将多维数据的差异反映在二维
坐标图上，进而揭示复杂数据背景下的简单规律。
而NMDS是非线性模型，其目的是为了克服线性模型的缺点，更好地反
映生态学数据的非线性结构，应用NMDS分析，根据样本中包含的物种信息，
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四、物种的注释与评估——ANCOM差异分析
ANCOM(Analysis of composition of microbiomes)是另外一种比较微生物组学 数据中物种在组间的显著性差异的分析方法。ANCOM分析不依赖于数据的分布假设， 克服了相对丰度分析法的一些限制，能够有效降低结果的假阳性，更准确的分析各分类 水平的物种在组间的差异情况。
的比例
——Circos图分析
宏基因组学的典型应用： 人类微生物组计划（HMP） 人肠道宏基因组计划（MetaHIT） 地球微生物组计划（EMP）
4
二、项目流程
Ø项目试验流程 Ø项目生信分析流程
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二、项目流程——试验流程
6
二、项目流程——生信分析流程
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三、测序数据处理——序列质控和去宿主序列
采用Illumina Novaseq平台对样本总DNA进行PE150（双端150bp长度） 测序，序列信息以FASTQ格式的文件保存，每四行对应一条测序Read。 为了提高分析的准确性和效率，数据分析之前要对下机测序数据进行过滤： 1）除去建库过程中在样本DNA上添加测序接头等序列； 2）除去会影响后续生物信息学分析准确性的测序过程中产生的低质量碱基和 序列； 3）除去样本中可能混杂的宿主DNA序列。
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一、项目概述
宏基因组学(Metagenomics)是一种直接对微生物群体中包含的全部基因组 信息进行研究的手段。它规避了对样品中的微生物进行分离培养，提供了一种对 自然环境中、不可分离培养的微生物进行研究的途径，更真实的反应样本中微生 物组成、互作情况，同时在分子水平对其代谢通路、基因功能进行研究。
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四、物种注释——物种组成分析
在研究中，经常探究样品中的哪些特殊物种，其中高丰度（优势）物种分 析是此类研究最常用的手段。 结果展示：丰度前20的菌门在各个样品中的分布柱形图
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四、物种注释
常用五种物种分组统计分析，包含： Ø1）聚类分析 Ø2）LEfSe差异分析 Ø3）ANCOM差异分析 Ø4）共有物种VENN分析 Ø5）多样性PCoA分析
免于培养的微生物学研究方法主要基于测序，高通量测序使我们一次可以 获得整个微生物群体的数据信息，简单来说包括两种策略： 1、基于特定标记基因的扩增测序方案（常见16s，ITs，18s或特定功能基因） 2、基于整个群落DNA进行测序，获取全部微生物基因组进而进行分类和功能 分析的策略（宏基因组测序metagenomics）。
在ANCOM分析中，W值是一个衡量组间差异显著性的统计量（类似F值，t值），W 值越高，代表该物种在组间的差异显著性越高。图中的每一个点都代表了一个比较的物 种，纵坐标代表W值，横坐标clr值代表组间样品丰度的差异程度，数字绝对值越高代表 相对丰度差异越大。因此在图中的点越靠近右上角（或左上角），则代表该物种与其他 物种（靠近横轴0位置的物种）相比更具有显著性差异。
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四、物种注释——样品多样性指数分析
目前适用于生态学研究的降维分析主要是主成分分析 (PCA，Principal
Component Analysis)和无度量多维标定法（NMDS，Non-Metric Multi-
Dimensional Scaling）分析。
其中，PCA是基于线型模型的一种降维分析，它应用方差分解的方法对
以点的形式反映在多维空间上，而不同样本间的差异程度则是通过点与点间的
距离体现，能够反映样本的组间或组内差异等。 基于不同分类层级的物种丰
度表，我们进行了PCA和NMDS分析，如果样品的物种组成越相似，则它们
在PCA和NMDS图中的距离则越接近。
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四、物种的注释与评估——样品多样性指数分析
PCA是主坐标分析（PCoA）的一种特殊情况（基于欧式距离的PCoA就 是PCA）。本报告利用PCoA分析方法，基于Bray Curtis距离来进行PCoA分 析，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示，图中样品的距离越接近， 表示样品的物种组成结构越相似。
为了研究样品物种组成及多样性信息，采用Kraken2对所有样品的全部 的有效序列进行注释分类。Kraken2是基于Kraken1研发的的最新版本 （2018）。
Kraken系列软件是一种使用精确k-mer匹配的分类系统，可实现高精 度和快速分类速度。该分类器将查询序列中的每个k聚体与包含给定k聚体 的所有基因组的最低共同祖先（LCA）匹配。
3.通过Bowtie2序列比对去除宿主序列： 微生物宿主DNA会对目的DNA造成干扰。基于参考基因组数据库，可以
通过序列比对的方法识别和去除宿主DNA。例如，使用Bowtie2和人类基因组 参考数据库hg38（GRCh38）可以识别和去除人体微生物群样本中的人类 DNA。
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三、测序数据处理——质量检查和统计
分类完毕，继续用Bracken对Kraken2得到的分类结果进行分类后贝叶 斯重新估算丰度，来估算宏基因组样本的物种水平或属级丰度。
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四、物种注释——物种组成分析
基于Bracken的绝对丰度及注释信息，对每个样品在7个分类水平（界、门、 纲、目、科、属、种）（Kingdom, Phylum, Class, Order, Family, Genus, Species )上的序列数目占总序列数的比例进行统计，可以有效的评估样本的物 种注释分辨率（注释到属/种的比例越高表示样本的注释效果越好）。图4-1展 示了每个样本中在各分类水平注释的相对程度:
横坐标（Axis 1）表示第一主成分，百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值；纵坐标 （Axis 2）表示第二主成分，百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值；Axis 3坐标表示第三主成 分，百分比表示第三主成分对样品差异的贡献值。可以根据元数据的分组信息可以个性化展示其他
分类的距离关系。
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五、功能数据库注释
每份DNA样品经Illumina Novaseq PE150测序都会得到两份数据：上游 序列Read1.fastq和下游序列Read2.fastq。序列过滤前和过滤后，都要用 FastQC统计这些序列的碱基质量并将结果进行可视化，以便于评价序列质量 和分析过滤效果。高通量测序中常用Q30（1/1000错误率）评价碱基质量的好 坏，不同Q值的意义如下：