宏基因组测序简介(发布版)
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组学
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序
宏基因组测序环境中超过99%的微生物是不可培养的，很多致力于研究微生物多样性的努力由于培养方法的限制而受到制约，为了克服由培养技术所带来的困难和限制，多种以DNA为基础的分子生物学的方法已经被开发。
目前16s rDNA测序可以提供大量关于环境微生物的群落及种类信息，但是在种群中不同微生物的作用以及其携带的基因组信息基本不能体现出来。
相比之下，宏基因组是一种新的，可用于快速分析微生物复杂基因组的方法，它提取环境中的全基因组DNA，构建DNA文库并进行高通量测序。
对数据进行分析，不仅能够获得环境中微生物的组成及丰度信息，还可以通过相关功能及代谢通路注释，获得这些微生物全面的微生物基因组信息，以及在环境中可能的功能。
技术参数样品准备测序策略推荐数据周期3ug DNA 300bp DNA文库HiSeq PE150测序一般测序数据量：5Gb clean data大测序数据量：10Gb clean data40个工作日建库方法技术流程技术特点（1）无需分离培养，直接提取样本DNA测序；（2）群落多样性、种群结构、进化关系、功能组成、相互协作关系等多种分析；（3）高效、高通量，一次性获取样本中所有微生物组成等信息。
部分结果展示进化树分析OTU维恩图抗生素类型统计图案例解析排泄物微生物宏基因组可作为结直肠癌标志物为了评估利用排泄物诊断结直肠癌的可行性，作者对来自于中国的74个结直肠癌患者和54个健康人的粪便样本进行宏基因组测序，发现除了已经证实的与结直肠癌相关的具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和消化链球菌（Peptostreptococcus stomatis）之外，微小微单胞菌（Parvimonas micra）和口臭致病菌（Solobacterium moorei）也与结直肠癌具有显著相关性。
作者随后选择了20个微生物基因标志物，通过q-PCR发现，来自于具核梭杆菌的丁酰coA脱氢酶和来自于微小微单胞菌的RNA聚合酶亚基β在患者的粪便微生物的基因组中高度表达；利用这两个基因可以准确区分患有结直肠癌的患者和健康人群。
宏基因组测序介绍
宏基因组测序介绍
宏基因组测序（Metagenomics Sequencing）又称为环境基因组测序，是一种对复杂环境中所有微生物生物群体的遗传信息进行分析的高通量测序技术。
与传统分离培养方式不同，宏基因组测序可以直接提取环境样品中所有微生物的总DNA，并通过测序技术进行分析，从而得到环境样品中所有微生物群体的遗传信息。
宏基因组测序的优点是高通量、快速、高效、无偏差、不需要微生物分离和培养，可以对满足各种环境条件的微生物进行整体性的研究，从而更加真实地反映生物在环境中的生态学特征，为生态学、环境保护等领域的研究提供了数据支持。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
病毒宏基因组测序
40
Eukaryotic DNA viruses
No. of samples
30
20
10
0
Unclass. ABneeAtallloptovhriarqiGtduoaaermeqviumrueCUasviMtrinrocucaorlssqvatuisarseud.vseCinriurocsvoivruiBrBsaiedbgaueoUvminruocGslvaMyiUsrrusoan.ssvcPtilrroaNueslvsyasion.ruGmosveaimBrvuoiirsncidaivapierairdvaoevirus
病毒宏基因组测序又称宏病毒组（Virome），是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。宏
病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具 测序策略与深度
分析内容
项目周期
病毒宏基因组测序
自然群体
DNA/cDNA总量≥3ug，浓度≥50ng/ul，无降解，无粘稠、无颜色异常，无RNA/蛋白质污染； 干冰寄送，使用无DNase管子存放，标记清晰。
（病毒富集、核酸提取和反转录、随机扩增可参考raw data
集数据库比对 基于reads的整合注释
多样本标准分析 丰度热图
主成分分析 聚类分析
显著性差异分析
35～75个自然日
案例解析
［案例一］ 针对炎症性肠病病毒基因组变化的研究[1]
本研究对剑桥、芝加哥、洛杉矶三个地区感染炎症性肠病（IBD）的人 群及其健康家属的粪便进行高通量测序，结果显示：在三组人群中有尾 目噬菌体和小噬菌体科物种相对丰度最高，并且两种病毒相对丰度呈负 相关趋势。比较剑桥地区IBD样本与对照，揭示了噬菌体丰度不成比例 主要与IBD有关，并初步验证肠病毒与IBD有关。
宏基因组测序讲解
或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组细菌多样性。如宏基因组
并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般
DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]equence based screening)两种方法。
宏基因组学的研究步骤
一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到
蛋白等的试剂盒，在食品工业、NA构建
模式微生物并不能把所
DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率
从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提
但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论
DNA提取方法的改进[68]。
(细胞提取法)。直接裂解法是将
继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、
)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、
但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以
DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，
DNA。此法可获得大片段
4个步骤。特别要指出的是，在基
其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因
(community)的混合基因组序
这种差别的关键就பைடு நூலகம்，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材
分离特定环境生物DNA
DNA的做法，而是首先直接收集能
然后利用各种理化方法破碎微生物，使
DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
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宏基因组测序是什么？
[13]Fields, S. (2001). Proteomics in Genomeland. Science, 291(5507), 1221–1224.
7
8
宏基因组学发展简史[1]
9
临床宏基因组学发展现状[1]
2019年前108篇临床mNGS研究现状： A. mNGS在疾病诊断中的应用：
宏基因组测序
宏基因组测序简介 宏基因组学发展 如何完成一次mNGS
难点与挑战
概要
2
3
“内因+外需”双轮驱动NGS需求
内因：感染性 疾病的新发和 再发对临床诊 断的准确性和 实效性提出更 高要求。
外需：“限抗 令”推动NGS在 该行业发展。
4
为什么进行宏基因组测序？
很多病原体培养困难。
用电镜观察病原体，其灵 敏性相对较低。
病人1（肾移植）：取脑组织、脑脊 液、血清、肾脏、肝脏样本测序；
病人2（肝移植）：取脑脊液和血清 样本测序（454）。
通过测序鉴定了一个新的沙粒病毒， 该病毒会通过实体器官移植传播。
14岁联合免疫缺陷症男孩； 休假回来后，脑膜炎发作； 6周内做了38项检测，均为阴性； 5种高档抗生素用药，均为康复； 脑脊液mNGS，48小时出结果（MiSeq）； 检测到475/10196620条reads，钩端螺旋体； 上青霉素，32天后康复出院。
核酸提取方法
没有充分破壁可能会使一些细菌的检测变得困难（DNA没有充分释放）。样本量小会降不包括片段化的病原体基因组；仅靠DNA测序不能检测到RNA病毒。
测序方法
深度不足难以检测低丰度物种。同一测序过程中的样本之间可能会发生污染。与单端barcode相比，双端barcode可降低污 染。
病原核酸富集： Dnase I，2-~650倍[24]； RNA探针+Rnase H，2~724倍[25]； 抗体或CRISPER捕获，验室背景。
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测序数据分析——生信的重要性
数据库！ 20
测序数据分析——数据量要求
样本类型 建议测序数据量
2016年，FDA发布NGS用于感染疾病监测指南：微 生物鉴定、抗菌药物耐药性、独立标志物[20]
2018年4月，高通量测序技术写入中国成人医院获得性 肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南[21]
201检测流程
样本采集
样本处理
NGS测序
数据分析
报告解读
质控！ 《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》 《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》
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样本采集与运输
选择直接的感染部位标本，尽量抗生素使用前，病症明显时进行无菌采集。
• 脑脊液/BAL：选择第2管进行NGS检测； • 痰液：生理盐水漱口2-3次以上，咳取深部痰液；气管插管或切开时，吸取深部痰； • 组织样本：采样后直接放入无菌管冻存； • 血标本：尽量在患者寒战开始时，发热高峰前30-60min取样。
应用场景有限：成本高，目前mNGS主要集中应用于重大疾病、突发公共卫生事件和特定病例人群，目前尚未纳 入常规临床检测。
普及程度较低：认知和接受程度不足，检测结果的科学判读证据与逻辑尚待证实。 耐药和突变的鉴定：病原序列在总测序序列中含量极低，难以进行基因水平的鉴定。 流程标准化：缺少统一标准。 检测准确性：报告中含多种病原信息，夹杂背景病原，需更准确的病原鉴定算法和更快的鉴定速度。 结果数据复杂。 污染：宿主核酸、污染物核酸。 耗时：测序流程耗时过长。
数据量/M
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报告解读[23]
原则：
• 剔除试剂、环境中引入的假阳性病原体信息； • 剔除比对流程中交叉引入的假阳性病原体信息； • 报告病原体信息原则上准确到种，），同时也应包
含相应的属信息； • 建议将临床高度关注和健康者样本中极少出现的病
原体信息优先呈现； • 时将某些部位（如呼吸道、皮肤、肠道等）的常见、
低温运输
17
样本处理
样本类型
血浆
脑脊液 肺泡灌洗液 全血 痰液
胸腹水 组织
人源背景细胞中位数 ~2.3×105 ~3×104 ~1×105
~7×106 ~1.5×107 ~5×107 ~107~108
样本要求量
1ml以上 5ml以上
5ml/3ml 1ml以上 1ml以上 100mg以上
检出限
• 细菌检出限：10~1000copies/ml； • 真菌检出限：10~1000copies/ml； • 病毒检出限：1000copies/ml； • 支原体/衣原体检出限：100~1000copies/ml； • 寄生虫检出限：10~100copies/ml
处理对照
阴性对照可以识别一些受污染的物种。内部阳性对照可减少实验变异性带来的偏差，提高对低水平物种的识别。
分析方法
小型精选数据库或高度严格的标准可能不包括新的或意想不到的物种，从而导致假阴性结果。未经整理的数据库或宽松的 标准也可能不正确的识别物种。
25
临床宏基因组应用的局限和挑战[23,31]
质谱(MALDITOF MS)[2,4]
mNGS[7-9]
优势
• 通量大； • 检测急性或以前的感染； • 低成本
• 快速； • 高灵敏度； • 准确。
• 中通量
• 金标准 • 低成本
• 高通量； • 高特异性； • 低人工成本； • 省时。
• 高通量； • 不依赖培养； • 无偏倚检测； • 可发现新病原体； • 抗生素/抗病毒预测； • 功能预测分析。
几秒到几 分钟（培 养后）
极个别顶尖三甲
1~2天 （Nanopor e可将时间 缩短至几 小时）
几乎未开展
6
定义：
宏基因组测序（MetaGenomics Next Generation Sequencing，mNGS），最早由威斯康辛大学植物 病理学部门的Jo Handelsman等于1998年提出，后被 伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter等 定义为“应用现代基因组学的技术直接研究自然状 态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分 离单一的菌株”[12]。
武汉金银潭医院收集了3份支气管肺泡灌洗液样本。 Illumina和纳米孔测序对基因组进行克隆和测序。 20,000个病毒测序片段。 与beta冠状病毒属B分支的基因组相匹配。 与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45，G772933.1）
的全基因组一致性超过85％。
13
mNGS走向临床——共识与指南[20-23]
优势：
1、无偏倚，如一个标本中既有曲霉菌又有白色念 球菌，培养时，如果白色念球菌生长较快，便会影 响曲霉菌的生长，所以培养是有偏倚的，但理论上， 宏基因组测序对病原学诊断是没有偏倚的。 2、广覆盖，可以同时检测多种病原（如细菌、真 菌、病毒、寄生虫、支原体/衣原体、分枝杆菌等）。 3、无需先证知识，mNGS可以无需提前知道该样本 中的感染病原。
3/100万； 1000/100万（与宿 主高相似度）
细菌
1/100万 （胞内感 染菌）
真菌 5/100万
寄生虫 10/100万
报告中需注意取样和样本处理过程中引入的污染。
罕见病原
结合临床 进一步确 认
22
宏基因组测序所需的设备
仪器设备 生物安全柜 移液器 超纯水仪（18.2兆欧） 紫外灯 冰箱 离心机和涡旋仪 天平/电子秤 金属浴/水浴锅 磁力架 超声打断仪 Qubit核酸定量仪 qPCR仪（定量） 凝胶电泳及成像系统 真空浓缩仪（如不需探针法富集病原核酸，则不需配置） PCR仪 测序仪（如果进行mNGS，建议配置NextSeq通量的测序仪，其他病原应用，可 配置MiSeq通量级别的测序仪。） 不间断电源（UPS） 片段分析仪（agilent、Qseq、PE labchip三个品牌选其一） 服务器（分析量较大时需单独配置机房，配置大型服务器）
试剂准备区 √ √ √ √ √ √ √
标本准备区 √ √
√√ √ √ √
√
测序区 √ √ √
√ √ √
23
24
正视mNGS在感染性疾病诊断中的偏好性[30]
样本收集方法
没有冷链或核酸稳定剂的样本收集可能会导致核酸降解和假阴性结果或一些生物体的过度生长，导致对丰度的误解。多次 冻融也会导致核酸降解。
75% 12
2019年12月26日——坊间发现
mNGS发现几十条SARS冠状病毒序列，且仅有 这一个有意义的病原体；
进一步分析，与Bat SARS like coronavirus有87% 相似，与SARS有81%相似。
补测数据，得到几乎完整基因组。
新冠病毒的发现
2019年12月30日——官方发现[19]
劣势
• 低灵敏性和特异性； • 对于细菌，相近的抗原易发生交叉反应。
• 检测特定感染； • 成本高于培养的方法； • 受扩增偏差影响； • 无法区分活细胞/死细胞。
• 结果稳定性、平行性差
• 准确率、可靠性依赖于技术经验； • 耗时耗力； • 敏感性会受到抗感染药物影响； • 难培养的病原不能鉴定。
用分布。
10
最早的宏基因组应用——环境宏基因组[14-15]
11
2008年——死后查因[16]
临床宏基因组应用先锋
2014年——首例临床，免死诊断[17]
2019年——病前预测[18]
3个病人在同一天接受同一个捐献者 的器官移植。在移植后4~6周均出现 发热后去世。
培养、PCR、血清学筛查、芯片检测 均为发现有用信息。
• 中枢神经系统； • 呼吸系统； • 消化系统； • 骨骼肌系统； • 视觉系统； • 血液循环系统； • 肝胆系统； • 泌尿系统； • 皮肤； • 其他。
B. 临床宏基因组研究的增长情况： C. mNGS研究在不同国家的分布情况； D. mNGS使用的技术平台分布； E. mNGS在不同感染疾病诊断中的应