宏基因组功能基因筛选
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组学
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
宏基因组测序技术
宏基因组测序技术
宏基因组测序技术（MGST）是指对环境或生态系统样品中所有微生物的基因组进行混
合测序。
与传统微生物组学研究方法不同，该技术不需要分离和培养微生物，可以将整个
生态系统中全部微生物的基因组信息同时得到，包括细菌、真菌、古菌以及病毒等。
MGST可以广泛应用于环境、农业、医学、食品安全等领域的研究。
在环境领域，可以通过MGST研究不同环境系统的微生物多样性、生态功能和生态系统变化等。
在农业领域，该技术可用于评估土壤微生物群落结构和功能，为农业生产提供参考。
在医学领域，MGST
可用于研究人和动物体内微生物群落的变化、病原微生物的筛选及预防与治疗。
MGST的技术流程包括：
1. DNA提取：将样本中微生物的总DNA提取出来。
2.文库构建：基于高通量测序技术对DNA样本进行文库构建，其中包括搭建文库、分
离目标DNA片段、连接DNA适配体、PCR扩增等步骤。
3. 测序：对文库样品进行测序，可以使用Illumina、PacBio、Oxford Nanopore等
先进测序平台。
4. 数据处理与分析：通过对测序数据进行质量控制、序列拼接、聚类分析、物种注
释等处理与分析，得到微生物群落多样性和功能的分布情况。
随着技术的发展，MGST的应用范围将进一步扩大，为自然界和人类社会带来更多的福利。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组功能基因筛选
SIGEX载体特点
一种操作子捕获 (operon trap) 载体 多拷贝，稳定性好 含有一个标记基因（如gfp），能够与受底物诱导的操作子 基因片段共表达 标记基因前有自身可诱导启动子，能够检测自连的载体； 标记基因前有RBS位点和起始密码子，避免形成融合蛋白
表达，利用“功能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因
高通量检测、筛选
功能基因、新型酶
Clone into vector
eg plasmid, cosmid phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisation
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR
异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组筛选的原理和流程
宏基因组筛选的原理和流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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三种筛选方法的比较
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (1❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组测序
宏基因组DNA提取 Illumina 高通量测序
组学系统分析
高通量基因克隆
利用测序结果，经序列比对分析， PCR直接扩增、克隆相关功能基因
通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 用Illumilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进建 抽提DNA 克隆(多种载体) 转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌)
Uchiyama et al.,Nature,2009
SIGEX筛选流程
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019
SIGEX的优点和缺点
优点
➢能够筛选到新的代谢相关基因 ➢诱导底物不需要经过特殊修饰 ➢避免了引入酶切位点的麻烦和切断目的基因的可能 ➢ 结合流式细胞术，适于高通量克隆和筛选
Chakravorty 等（2019）总结16S rDNA 的序列，及其中 九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的 可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6 区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。
16S rDNA
➢通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然 后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或 V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物 种丰度、种群结构、系统进tagenomic Library
通过PCR 或者杂 交筛选特定序列
SIGEX
通过功能筛选特 定表型的阳性克
隆
基于宏基因组分离筛选功能基因 的四个技术要素
载体 Vector
环境样品DNA制备 DNA Preparation
自然产品筛选平台
Natural Product Discovery Platform
➢ 异位裂解法：采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来, 然后采 用较温和的方法抽提DNA, 如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞, 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解, 脉冲场凝胶电泳回收 DNA。 可获得大片段DNA (20～500 kb) 且纯度高, 但操作繁琐, 成本高, 有 些微生物在分离过程中可能丢失, 温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。
载体
➢ 一般选比较复杂的化合物，因其基因簇较大 ，则无法完整克隆。
➢ 细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断 ，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。因而可选要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。
✓16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对 应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为 1500 bp
✓通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细 菌的分类和进化分析。
细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析
Ashelford 等（2019）通过对4383个细菌16S rDNA的序列 进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区 （V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲 缘关系，可变区则表明物种间的差异。
screening），即底物诱导基因筛选，其基本原理 为：代谢相关基因通常由相应的化合物（如底物或 者代谢）与载体中的特定标签（如GFP）共表达的克隆子， 就能够筛选到相应的代谢基因。利用特殊载体，建立宏基因组，通过流式细BP和BL反应
Matsuyama and Yoshida，2009
Gateway 技术优点
不需要传统的酶切、连接方法 利用位点特异性重组，省时省力,可以实现高通量克隆 利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆,
典型的效率是>95% 在目的基因（或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®
ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一 致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种 间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目 前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属 内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。
Metagenome VS Genome
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S (1❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA
入 门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体， 创建各种各种各样的表达克隆
The Gateway® system 克隆ORFeome
利用The Gateway® system 的高通量、快捷、方便等特点，可以克 隆得到生物体的ORFeome，即全部编码蛋白质的ORF组成
Brandner et al., BMC Genomics,2019
此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白 质中的新分子，且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率， 缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全 新的活性物质及其功能编码基因。
功能驱动筛选
生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行 功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子， 结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。
ORFeome的用途
得到生物体的ORFeome后，通过高通量诱导ORF 表达，利用“功能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因
高通量检测、筛选
功能基因、新型酶
缺点
➢不能筛选组成型表达的基因 ➢仅针对能进入细胞质的底物 ➢仅适用于插入片段带有自身启动子的情况 ➢出发菌株须与宿主菌株近缘 ➢T载体容量有限，>10kb的基因或操纵子难以克隆 ➢与GFP反向插入的目的基因将漏检 ➢目的基因与GFP之间有转录终止子的情况将漏检
Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2019
宏基因组功能基因的筛选
WCX 2019年3月17日
目录
❖ 宏基因组简介 ❖ 宏基因组的常用研究方法
➢ 16S❖ 宏基因组的测序
—功能基因筛选（策略二）
宏基因组（Metagenome）
• Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于2019年提出，定义为 “the Genomes of the Total Microbiota Found in Nature”， 即指任何特定环境样品中全部微生物 遗传物质的总和, 并且目前主要是指环境样品中细 菌和真菌基因组的总和。
真菌ITS的高通量测序分析
➢ITS(Internal Transcribed Spacers )，即核糖体内转录间隔 区 ，是位于 28S rDNA的3’端与 18S rDNA的 5’端之间的序列 ➢ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bp ➢ITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1 位于 18S rDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间
高通量筛选 High Throughput
Screening
宿主Host
环境样品DNA制备
➢ 原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理, 继而抽提纯 化。 此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小, 但由于强烈的 机械剪切作用, 所提取的DNA片段较小(1-50 kb)，且腐殖酸类物质也 难以完全fosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠 杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基因的重要。
序列驱动筛选
基于DNA序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能基 因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过杂交 或PCR扩增筛选阳性克隆子。
Metagenomic library
sequence
Screen for specific sequences by PCR or hybridisation
SIGEX
Functional screening for expression of particular phenotype
细菌16S rRNA的测序分析
Environmental sample
Extract metagenomic DNA
Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR
Clone into vector
eg plasmid, cosmid
phosmid, BAC
Introduce into host eg E. coli
高通量克隆ORF ——The Gateway® system
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染 色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合 与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个 反应构成的。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克 隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门 克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载 体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转 移目的序列到一个或更多个目的载体。
如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀 粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大 ，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。