蛋白质纯化--盐析沉淀法
盐析法沉淀蛋白质的原理
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
盐析法是指在药物溶液中加入大量的无机盐，使某些高分子物质的溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的方法。
盐析法主要用于蛋白质的分离纯化。
常作盐析的无机盐有硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。
还有其他方法能够沉淀蛋白质，比如重金属盐沉淀蛋白质
蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。
因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离子结合成盐。
重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。
临**利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。
蛋白质盐析沉淀注意什么
蛋白质盐析沉淀注意什么蛋白质盐析沉淀是一种常见的蛋白质分离和纯化方法。
在进行蛋白质盐析沉淀实验时，需要注意以下几点。
一、样品准备1. 蛋白质纯度：蛋白质盐析沉淀通常适用于纯度较低（小于90％）的混合蛋白质样品。
纯度较高的蛋白质样品可能不适合盐析沉淀。
2. 样品浓度：样品浓度越高，盐析沉淀效果越好。
通常建议将样品浓度调整到1-10 mg/mL之间。
二、选择盐类1. 效应盐：常用的盐类包括氯化铵（NH4Cl），硫酸镁（MgSO4），硫酸铵（（NH4）2SO4）等。
选择盐类时应考虑蛋白质的特性，如等电点，溶解度等。
2. 盐浓度：盐浓度决定了蛋白质与水溶液中盐发生的相互作用。
通常情况下，建议初始盐浓度为0.2 M-0.6 M。
三、溶液调整1. 缓冲液：选择适当的缓冲液调整pH，以维持蛋白质的稳定性。
2. 添加剂：有时需要添加其他物质来增强蛋白质的稳定性和盐析沉淀效果，如PEG（聚乙二醇），酒精等。
四、操作条件1. 温度：通常在低温（0-10）下进行盐析沉淀，以减少蛋白质的活性丧失和减慢沉淀速度。
但不同蛋白质可能对温度敏感，需根据实验要求进行调整。
2. 剪切力：避免过多的搅拌、震荡和搅拌，以减少蛋白质的结构破坏。
五、沉淀收集1. 沉淀形态：蛋白质盐析沉淀可呈现不同形式，如团块状、颗粒状等。
需要根据实验需要选择适当的沉淀形态。
2. 沉淀收集：通过一定的分离技术（如离心、过滤等）将蛋白质沉淀从上清液中分离。
收集到的沉淀应及时冷冻或冷藏保存，避免蛋白质的结构和活性丧失。
六、结构和活性分析1. 盐析沉淀后的分离物可以通过SDS-PAGE、Western blot等技术进行纯度和结构分析。
2. 通过酶活性测定等方法，判断蛋白质盐析沉淀对蛋白质结构和功能的影响。
蛋白质盐析沉淀是一种重要的蛋白质分离和纯化方法，它可以通过调整盐浓度和温度等条件，实现蛋白质的高效沉淀。
但在操作过程中，需要注意蛋白质的性质、溶液的调整、操作条件和沉淀收集等方面。
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法The manuscript was revised on the evening of 2021蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。
本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。
-------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一我是超级蜘蛛精看我有劲儿不？冲啊，我是美国队而我是一只冷静的科研小蜗牛这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。
硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。
蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。
每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。
硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。
各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。
在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。
（1）参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH到。
盐析法沉淀蛋白质的原理
盐析法沉淀蛋白质的原理盐析法是一种常用的蛋白质沉淀方法，其原理是利用盐对蛋白质的溶解度的影响，使蛋白质发生沉淀。
盐析法可以用于蛋白质的提纯和分离，是生物化学实验中常用的重要技术手段。
在盐析法中，盐对蛋白质的溶解度有着重要的影响。
一般来说，蛋白质在高盐浓度下会发生沉淀，而在低盐浓度下则会溶解。
这是因为盐的存在会改变水分子的结构，使得水分子更倾向于与盐结合，从而减少了与蛋白质结合的水分子数量，导致蛋白质发生沉淀。
因此，通过逐渐增加盐的浓度，可以使蛋白质逐渐沉淀下来。
在实际操作中，盐析法通常是在蛋白质溶液中逐渐加入盐，并在每次加盐后进行充分的搅拌混合，直至达到所需的盐浓度。
随着盐浓度的增加，蛋白质会逐渐发生沉淀，形成白色或乳白色的沉淀物。
此时，可以通过离心将沉淀物沉淀下来，获得相对纯净的蛋白质。
盐析法的原理简单清晰，操作也相对容易。
但在实际应用中，需要注意一些细节问题。
首先，选择合适的盐对蛋白质的沉淀效果有着重要的影响。
一般来说，硫酸铵是一种常用的盐析剂，但对于不同的蛋白质可能需要选择不同的盐。
其次，盐析法需要在较低的温度下进行，一般在4摄氏度以下，以减少蛋白质的降解和变性。
最后，盐析法得到的蛋白质溶液可能还需要经过进一步的纯化步骤，以获得更纯净的蛋白质。
总之，盐析法是一种简单有效的蛋白质沉淀方法，其原理是利用盐对蛋白质溶解度的影响。
通过逐渐增加盐的浓度，可以使蛋白质发生沉淀，从而实现蛋白质的提纯和分离。
在实际操作中，需要注意选择合适的盐、控制温度，并可能需要进行进一步的纯化步骤。
盐析法在生物化学实验中有着广泛的应用，是研究蛋白质功能和结构的重要手段之一。
盐析法沉淀蛋白质的原理
1.盐析法沉淀蛋白质的定义
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
这也就是我们所说的盐析，具体而言，指的就是蛋白质水溶液中加入中性盐，随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象。
中性盐是强电解质，溶解度又大，在蛋白质溶液中，一方面与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜;另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出。
2. 盐析法沉淀蛋白质的原理一：破坏了水化层
在高浓度的中性盐溶液中，由于盐离子亲水性比蛋白质强，与蛋白质胶粒争夺与水结合，破坏了蛋白质的水化层。
在高浓度的中性盐溶液中，由于蛋白质和盐离子对溶液中水分子都有吸引力，产生与水化合现象，但它们之间有竞争作用，当大量中性盐加入时，使得盐解离产生的离子争夺了溶液中大部分自由水，从而破坏蛋白质的水化作用，引起蛋白质溶解度降低，故从溶液中沉淀出来。
3.盐析法沉淀蛋白质的原理二：破坏了电荷
由于盐是强电解质，解离作用强，盐的解离可抑制蛋白质弱电解质的解离，使蛋白质带电荷减少，更容易聚集析出。
4.盐析法的应用：
盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、蛋白质的浓缩等。
盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化。
蛋白质纯化方法及问题解答
蛋白质纯化一．可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1．Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。
2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。
也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。
在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。
当需要切除时：的蛋白质最少1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。
100 OD280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。
可用1 OD2802) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
蛋白质沉淀的方法
蛋白质沉淀的方法
蛋白质沉淀是一种通过加入沉淀剂使溶液中的蛋白质沉淀下来的方法，以下是几种常用的蛋白质沉淀方法：
1. 盐析法：通过加入高浓度的盐溶液，如氯化铵或氯化铵硫酸铵混合溶液，使溶液中的蛋白质沉淀下来。
由于盐浓度的变化会改变蛋白质的溶解度，从而使蛋白质沉淀出来。
2. 酸沉淀法：通过加入弱酸，如醋酸或盐酸，使溶液中的蛋白质变性，从而导致蛋白质沉淀。
酸沉淀法常用于从乳液、血清或细胞裂解液中提取蛋白质。
3. 醇沉淀法：通过加入有机溶剂，如乙醇或异丙醇，使溶液中蛋白质与水产生排斥作用，从而使蛋白质沉淀下来。
醇沉淀法常用于从水溶性蛋白质中提取。
4. 聚合物沉淀法：通过加入聚合物，如聚乙二醇，在溶液中形成络合物，从而使蛋白质沉淀。
聚合物沉淀法常用于从复杂的样品中分离蛋白质。
5. 冷冻沉淀法：通过将溶液在低温下冷冻，使蛋白质变性和聚集，然后离心沉淀。
冷冻沉淀法常用于从细胞裂解液或组织提取物中分离蛋白质。
这些方法可以根据实验需求和样品类型进行选择和优化，以获得最佳的蛋白质沉淀效果。
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三 操作步骤
2 盐析
（1）将50ml细胞裂解液置于100ml烧杯中，加入搅拌磁棒后放 置在磁力搅拌器上 （2）在搅拌状态下缓缓加入研细的（NH4）2SO4末至最佳饱和 度之前的一级饱和度，静置2小时后,离心得上清 （3）在搅拌下向上清中添加研细的（NH4）2SO4粉末，使终浓 度达最佳饱和度，静置2小时后离心收集目的蛋白沉淀 （4）将沉淀的蛋白质溶解于尽量小体积的磷酸盐缓冲的生理盐 水中，用Bradford试剂测定蛋白质浓度后，置-20℃冰箱中保存 备用。
三 操作步骤
（3）分别向上述装有（NH4）2SO4粉末的离心管中 添加0.5ml细胞裂解液，充分振荡使（NH4）2SO4溶 解后，在室温下静置2小时； （4）将离心管放置于离心机中，以1000转/分转速离 心5分钟后，倾去上清，倒立离心管，以便尽可能多 地去除上清； （5）添加0.5ml蒸馏水及8μl30%三氯乙酸混匀,静置 10分钟后,离心,尽量去除上清；(因此步会造成蛋白质 不溶影响后续工作，所以省略)
大肠杆菌BL21（DE3）pGEX-6p细胞裂解液，由上一 实验提供 分析纯硫酸铵：用干净的磁研钵研成细粉末。
30%三氯乙酸, SDS-PAGE所需试剂
三 操作步骤
1 盐析曲线的测定 对于一求知盐析特性的蛋白质来说，用盐析 作为一纯化步骤时，应首先用实验确定使此 种蛋白质盐析沉淀出来的最佳饱和度，其测 定方法如下： （1）取7支微量离心管，用记号笔在管帽 上标记20%、30%、40%、50%、60%、70% 和80%； （2）以上述离心管作容器分别称取磨细的硫 酸铵晶体末0.057克、0.088克、0.122克、 0.156克、0159克、0.235克和0.281克；
一 实验原理
盐析的一般操作步骤是，选择一定浓度 范围的盐溶液（如0-25%饱和度的硫酸 铵）使部分杂质呈“盐析”状态从溶液 中沉淀出来，经离心法去除。而目的蛋 白质呈盐溶状态，存在于上清中。增加 盐浓度（如25-60%饱和度的NH4SO4） 使目的蛋白质呈盐析状态，而从溶液中 分离出来。
二 实验试剂
四 思考题
1. 为提高蛋白质盐析分离效率，应采取哪些 措施？ 2.为测定用硫酸铵盐析法分离某种蛋白质的 最佳硫酸铵浓度，除采用本讲义设计的操作 程序之外，请你设计另一种工作程序测定盐 析目的蛋白质的硫酸铵最佳浓度，并指出两 种方法的优缺点。 3 请你计算25℃时60%饱和度的硫酸铵溶液的 离子强度。
三 操作步骤
（6）将离心管置于快速干燥器中干燥30分钟； （7）向离心管中添加100μISDS-PAGE上样缓冲液悬 浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分钟，பைடு நூலகம்出置-20℃冰箱 中备用； （8）制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶；按下列上样顺序向 加样孔中添加10μl 样品： 样孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 包涵体样20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 包涵 体 空白对照 电泳分离后，染色、脱色、观察目的蛋白质出现在何 种浓度的（NH4）2SO4盐析样孔中，以确定最佳的 盐析条件。
实验 五 蛋白质纯化--盐析沉淀法
一 实验原理
蛋白质在稀盐溶液中，其溶解度会随盐浓度的升高而 增加，此种现象被称作盐溶。但是当盐的浓度继续增 高时，蛋白质的溶解度又以不同程度地下降并先后从 溶液中析出，此种现象被称为盐析。 上述现象 是由于蛋白质分子中极性基团之间存在静电 力。在低盐浓度下，蛋白质分子中极性基团之间的静 电力受盐离子的影响而被消除，蛋白质在水中的极性 基团的电荷被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子 之间相互聚集并从溶液中析出。盐析法就是根据不同 蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同 而达到彼此分离的方法。