Trizol法提RNA操作说明书
TRIZOL说明书
trizol 中文说明书trizol 试剂是一种从组织及细胞中提取总rna的专用试剂。
这种试剂是一种酚和硫氰酸胍的单相溶液，是将chomczynski 和sacchi发明的一步rna提取法的改进。
在样品匀浆或分析过程中，trizol 试剂可在分裂细胞及溶解胞膜的同时保持rna的完整。
在匀浆后加入氯仿，可将溶液分为水相和有机相。
rna均在水相中。
吸取水相加入异丙醇，得到rna沉淀。
去除水相后，样品中的dna及蛋白质可通过进一步连续的沉淀而得到。
中间相加入乙醇可沉淀dna而有机相加入异丙醇则能沉淀出蛋白质。
dna的再纯化可能对标化样品的rna产量有作用。
2．这一技术可以用于人，动物，植物或细菌株的微量组织（50—100mg）及细胞（5×106），也可以用于大量检材（≥1g）及细胞(﹥107).该方法简便易行,可用于同时检测大量样品,全部过程1小时内可以完成.用trizol 试剂分离的rna 没有dna及蛋白质成分.这种rna可用于northern印迹分析,斑点杂交,多聚(a)+检出及vitro转移, rna酶蛋白分析及分子克隆.用于pcr反应时,当两个引物位于同一外显子时应用扩增特异dna酶i处理提取出的rna.3． trizol 试剂可用于分子量从大到小的各种rna的提取.例如,大鼠肝脏提取出的rna,经琼脂糖凝胶电泳,eb染色后可显现出7kb和15kb的大分子量的rna谱带(包括mrna和hnrna), 位于～5kb(28s)和～2kb (18s)的两条主要的核糖体rna谱带及大小在0.1kb-0.3kb之间的低分子量rna(trna,5s).分离出的rna当溶于双蒸水中时a260/280为1.6-1.8之间.每毫克组织所能提取的rna量约为:肝和脾,6-10μg;肾,3-4μg;骨骼肌和脑,1-5μg;胎盘,1-4μg.从1×106培养细胞中提取的rna量约为:上皮细胞,8-15μg;成纤维细胞,5-7μg.需要但未提供的试剂:1. 氯仿2. 异丙醇3. 75%乙醇(depc处理水配制)4. 无rna酶水或0.5%sds溶液(制备无rna酶水:将水倒进无rna酶的玻璃容器中,加入depc至0.01%(v/v)放置过夜后高压灭菌). sds溶液必须用depc处理后高压灭菌的水配制.rna分离提取步骤:1．匀浆a. 组织每50-100mg组织加入1ml的trizol 试剂后用匀浆机或玻璃棒匀浆。
总RNA的提取（Trizol法提取）（PDF）
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
【精品】Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南48
【精品】Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南48Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南 (破碎组织?分离RNA?沉淀RNA?洗涤RNA?融解RNA?保存RNA) 1 试剂:三氯甲烷(氯仿)，异丙醇，75?乙醇，无RNase的水、Trizol reagent 2 材料与仪器:EP管匀浆器移液枪漩涡振荡器低温高速冷冻离心机冰袋电泳仪琼脂糖凝胶超净工作台3 操作步骤:3.1 准备工作A 玻璃匀浆器、75?乙醇预冷，离心机预冷至4? 打开超净工作台紫外灯15分钟以上B 用酒精擦拭台面 EP管标记3.2. 匀浆处理1 取一定量的纯化过的孢子悬浮液，12000rpm ，离心5min，弃上清 a 或者用匀浆仪进行匀浆处理，悬浮液不经离心，直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.，然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器，转移至1.5ml EP管中b 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次.(离心取细胞，67每5-10×10动物、植物和酵母细胞或每10细菌细胞加1ml Trizol。
加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理) 2 1ml Trizol Reagent，震荡混匀3. 将匀浆样品在15-30?放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
4. 可选步骤:4 ? 12 000rpm离心10min，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
5. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。
TRIZOL试剂提取细胞RNA和蛋白步骤
TRIZOL试剂提取细胞RNA和蛋白步骤
1. 0.3-0.4 ml Trizol 加入每个6 cm皿，刮取细胞到离心管中，静置5-10分钟。
2. 加入0.1 ml氯仿，震荡，静置10分钟，4度13000 rpm 离心15分钟。
3. 取上清用于提取RNA，下层用于提取蛋白。
上清的处理(RNA)：
1、上清打入新的RNase free离心管，加等量异丙醇，震荡，静置10分钟。
2、4度12000 g离心15分钟，弃去上清（倒掉，枪头在管口吸），沉淀为RNA。
3、加入1 ml 75% 乙醇（现配，用DEPC水稀释无水乙醇）洗涤沉淀。
4、4度12000g 离心5分钟，弃去上清（倒掉，枪头在管口吸），管口倒置，在卫生纸上，晾干15分钟。
5、加入20微升DEPC水溶解沉淀，微量分光光度计测质量。
下层的处理(蛋白)：
1、把中层吸掉，下层液加200微升无水乙醇混匀，静置5分钟，4度5500rpm离心10分钟，取上清移入新的离心管。
2、往新的离心管液体里加入1毫升异丙醇，充分混匀，室温静置10分钟，4度13000rpm 离心10分钟，弃上清。
3、加入1毫升0.3 mol/L 95%乙醇盐酸胍溶液，室温静置20分钟，4度13000rpm离心10分钟，弃上清。
4、重复步骤3 2次
5、加入1毫升无水乙醇，室温静置20分钟，4度13000rpm离心10分钟，弃上清。
6、室温干燥15分钟，用现配1% sds溶液溶解蛋白，不溶物以4度12000rpm离心10分钟去除。
7、上清液与5x loading buffer混匀，煮沸10分钟，存于-20度冰箱待用。
trizol提取RNA说明书
Trizol 使用说明书一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化 RNA。
RNA 质量的高低常常影响cDNA 库，RT-PCR 和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。
Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）三、准备工作RNase 酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是 RNase 完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与 RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC 配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取 RNase-free 的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC 使 DEPC 的终浓度为 0.1%。
注意：DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将 DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C 烘烤 3 小时以上。
诺维赞trizol说明书
诺维赞trizol说明书1、该法从细胞中提取RNA——用匀浆器将组织磨碎，加入TRIzol处理组织。
5分钟后加入氯仿，以每分钟12000转离心5分钟，样品即分成水样层、中间层和有机层。
2、RNA存在于水样层中，收集水样层后可以通过异丙醇沉淀RNA来还原。
3、在除去水样层后，中间层中的DNA和蛋白质也能相继以沉淀的方式还原：乙醇能使中间层的DNA沉淀析出，在中间层中加入异丙醇能沉淀出蛋白质。
4、每100mlTRIzol可以抽提100个六孔板中的样品或100个50-80mg的组织样品。
无论样品是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织（50-100mg)和细胞（约五百万个）及大量的组织（≥1g）和细胞（超过一千万个）均有较好的分离效果。
5、每一百万细胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA，每毫克组织用TRIzol抽提可得1-10微克RNA（产量因细胞和组织不同而异）。
6、TRIzol操作上的简便性允许其同时处理多个样品，所有的操作可以在一小时内完成。
7、TRIzol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白质的污染，故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA 酶保护分析和单分子克隆（PCR）。
8、如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNaseI(Cat.No.18068）来处理抽提的总RNA。
9、TRIzol试剂能促进不同种属、不同分子量大小的多种RNA 的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA经过琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7kb和15kb之间的不连续的高分子量条带（mRNA和hnRNA成分），两条优势核糖体RNA条带位于~5kb（28S）和~2kb（18S），低分子量RNA介于0.1和0.3kb之间(tRNA,5S）。
当抽提的RNA用TE稀释时，其A260/A280比值≥1.8。
抽提小RNA时宜-70℃沉淀过夜。
TRIzol-法提取血液总RNA
TRIzol 法提取血液总RNA
一、所需试剂、耗材
1. 0.1% DEPC-DDW;
2. 5ml, 2ml, 1.5ml灭菌离心管；
3. TRIzol；
4. 氯仿；
5. 异丙醇；
6. RNase-free water；
7. 70% DEPC-EtOH;
8. 检测用胶盒等
二、操作步骤
1. 取经过DEPC-DDW泡过，且灭菌烘干的7 ml 离心管；
2. 在0.5 ml小鼠全血（4C）中加入3 ml的TRIzol，震荡摇匀，室温静置5 min；
3. 将上述混合液体转移到灭菌的2 ml离心管中，12000 rpm 4℃离心5 min；
4. 将上清液移至新的1.5 mL离心管中；
5. 加入0.2 ml的氯仿，震荡摇均匀，室温静置5 min；
6. 12000 rpm 4℃离心15 min；
7. 将上清液移至新的1.5 ml离心管中，加入等体积-20C预冷的异丙醇，
-20C静置10 min；
8. 12000 rpm 4℃离心10 min；
9. 向沉淀中加入1 ml 70% DEPC-EtOH清洗沉淀;
10. 12000 rpm 4℃离心15 min;
11. 弃上清液保留沉淀，室温干燥10 min；
12. 加入30 μl RNase-free DDW 溶解RNA沉淀；
13. OD值检测（OD260/OD280=1.8-2.0）以及1% agrose gel检测（5ul）；
14. -80℃保存。
28S
18S
5.8S。
RNA提取trizol试剂盒说明书
注：各种样品的最大使用量（1ml Trizol）操作步骤：1. 在液氮中将组织(单头飞虱)研磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5ml离心管中。
细胞经计数后直接加入离心管，然后5000rpm室温离心去上清。
每100mg组织或5×106个细胞加1ml的Trizol。
注意：如果组织量（1-10mg）或细胞数很少（1×102-1×104），在样品中加入800μl的Trizol，用枪头反复抽吸混匀，再加入糖原（终浓度为250μg/ml），剧烈振荡或用匀浆器匀浆。
2. 用1ml针筒，26-G号（6#）针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5-ml离心管中。
3. 加入200μl氯仿/异戊醇（24:1）或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。
4. 台式离心机上，12000rpm，室温离心5分钟。
5. 将上清液小心转移到RNase-free 1.5ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，室温下放置5分钟。
（注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染）6. 台式离心机上，12000rpm，室温离心5分钟。
7．小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。
8. 用70%酒精洗涤两次，每次700μl，12000rpm，室温离心2分钟。
9. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。
10. 真空离心干燥3-5分钟，或放在室温下使酒精完全挥发。
11. 沉淀用30-50μl DEPC-H2O溶解。
如发现沉淀难溶，68℃处理10分钟。
对于胰腺，肾等组织中RNase含量很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解。
12．DNA的分析和定量：（1）测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。
按1 OD=40μg RNA计算RNAD的产率：OD260/280在1.8-2.0视为抽提的RNA纯度很高。
若需精确量化，只有浓度在4μg/ml以上的样品适于用光度计测定。
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Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、异丙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品
250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA
1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。
另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
五、从细胞中提取总RNA
1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2 /ml比例加入。
2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
六、操作步骤
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
注：此时可放入-70℃长期保持。
2、12,000rpm离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
注：禁用漩涡
振荡器，以免基因组DNA断裂。
4、4℃12,000g离心15min。
注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。
注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
7、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。
注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。
注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
12、测O.D值定量RNA浓度。
（注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug）
注：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase 的主要来源；组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织剪碎，然后再充分研磨。