最小抑菌量
抑菌剂效力检查法指导原则
抑菌剂效力检查法指导原则抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖，尤其是多剂量包装的制剂，避免因药物微生物污染及变质而对患者造成伤害。
在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。
同时，为保证用药安全，最终包装容器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。
要求具有抗菌活性的制剂（参见制剂通则），不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力。
抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低，因此，应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。
本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。
产品分类需要进行本试验的药品分为四类（见表1），以便标准的制定和执行。
表1 产品分类类别 药品1 类 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂2 类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂3 类 口服制剂（非抗酸制剂）4 类 抗酸制剂培养基培养基的制备1.胰酪胨大豆肉汤培养基酪蛋白胨 17.0g 磷酸二氢钾 2.5g大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0 g 氯化钠 5.0g葡萄糖 2.5g 水 1000ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH约7.0，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后为7.3±0.2，分装，灭菌。
2. 胰酪胨大豆琼脂培养基除上述胰酪胨大豆肉汤培养基的处方和制法，加入14.0g琼脂，调pH使灭菌后为7.3±0.2，分装，灭菌。
微生物学与免疫学习题8参考答案
微生物学与免疫学习题8参考答案一名词解释1．最小杀菌浓度：最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）：杀死99.9%（降低3个数量级）的供试微生物所需的最低药物浓度。
有些药物的MBC与其MIC非常接近，如氨基糖苷类。
有些药物的MBC比MIC大，如β内酰胺类。
如果受试药物对供试微生物的MBC≧32倍的MIC，可判定该微生物对受试药物产生了耐药性。
2．最小抑菌浓度：最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。
3．获得耐药性:对原来敏感的抗生素通过遗传性的改变而获得了抗药性4．多重耐药性：同时对两种以上作用机制不同的药物产生的抗药性5．交叉耐药性：对结构类似或作用机制类似的抗生素均有抗药性6．赖药性：不仅对该药物具有抗性，而且需要该药物作为特殊的营养因素7．耐受性：该菌在最低抑菌浓度时仍受到抑制，但最低杀菌浓度提高8．免疫(immunity)是指机体识别和排除抗原性异物，执行免疫防卫，维持自身生理平衡与稳定的功能。
9．免疫原性：刺激机体产生免疫应答，包括产生抗体或效应T淋巴细胞的性能。
10.免疫反应性：指与抗体或效应T细胞发生特异性结合的能力。
二．选择题1．IMVC试验最常用于鉴定下列何种细菌（B）A．化脓性球菌B．肠杆科细菌C．厌氧性细菌D．结核分枝杆菌E．霍乱弧菌2．与内毒素有关的细菌结构是AA．外膜B．核膜C．线粒体膜D．荚膜E．细胞膜3．内毒素的主要成分为EA．肽聚糖B．蛋白质C．鞭毛D．核酸E．脂多糖4．革兰阳性菌细胞壁与致病有关的化学组分是DA．N-乙酰胞壁酸B．磷壁酸C．壁磷壁酸D．膜磷壁酸E．脂肪酸5．青霉素的抗菌机理是EA．破坏肽聚糖的聚糖支架B．损害细胞膜C．干扰菌细胞的酶系统D．作用于核糖体抑制蛋白质合成E．抑制四肽侧链D-丙氨酸与甘氨酸交联桥的连结6．下列哪种细菌具有异染颗粒AA．白喉棒状杆菌B．百日咳鲍特菌C．流感嗜血杆菌D．伤寒沙门菌E．铜绿假单胞菌7．与细菌侵袭力有关的结构是BA．芽胞B．荚膜C．细胞壁D．中介体E．核糖体8．破坏热原质最有效的方法是EA．高压蒸气灭菌B．紫外线照射C．酒精D．煮沸E．高温干烤9．对人致病的细菌大多是DA．专性需氧菌B．专性厌氧菌C．微需氧菌D．兼性厌氧菌E．以上都对10．细菌代谢产物中与致病性无关的是EA．外毒素B．内毒素C．侵袭性酶D．热原质E．细菌素11.分离致病性肠杆菌科细菌最合适的培养基是CA.普通培养基B.血琼脂培养基C.选择培养基D.鉴别培养基E.厌氧培养基12．不能与红汞同时使用的化学消毒剂是DA．漂白粉B．乙醇C．新洁尔灭D．碘液E．洗必泰13．对血清培养基的灭菌，应选用CA．煮沸法B．巴氏消毒法C．间歇灭菌法D．流通蒸气灭菌法E．高压蒸气灭菌法14．常用的碘液浓度为CA．10g/L B．20g/L C．25g/L D．30g/L E．50gL15．乙醇消毒剂常用的浓度是CA．100％B．95％C．75％D．50％E．30％16．下列消毒灭菌法哪种是错误的AA．金属器械——漂白粉B．排泄物——漂白粉C．饮水——氯气D．含糖培养基——间歇灭菌法E．人或动物血清——滤过除菌17．新生儿预防淋病奈瑟菌所致的脓漏眼的消毒剂是AA．20~40g/L龙胆紫B．1g/L高锰酸钾C．20g/L红汞D．10g/L硝酸盐E．20g/L碘液18.在病原微生物的分类中，属于第一类的是DA.脊髓灰质炎病毒B. 天花病毒C.登革病毒D.新生隐球菌E.小鼠白血病病毒19. 在病原微生物的分类中，属于第二类的是BA.新疆出血热病毒B.汉坦病毒C.轮状病毒D.流感病毒E.破伤风梭菌20.属于高致病性病原微生物是AA.天花病毒B.登革病毒C.流感病毒D.志贺菌E.沙眼衣原体【参考答案】1．B 2．A3．E4．D 5．E 6．A7．B 8．E 9．D10．E 11.Ｃ12．D 13．C 14．C 15．C16．A 17．D18.B 19.B20.A三．填拱题1．口服给药制剂细菌总数≤1000个/g或≤100个/mL；霉菌和酵母总数≤100个/mL（或/g），不得检出大肠埃希菌.2．在控制菌（病原菌）的检查中口服药—不能检出沙门氏菌、大肠杆菌；外用药、眼科制剂—不能检出金葡菌、绿脓杆菌；深部用药不能检出破伤风梭菌。
抗菌药物药效学与药动学参数解读
抗菌药物药效学与药动学参数解读抗菌药物是一类能够抑制或杀灭细菌的药物。
药效学和药动学是研究抗菌药物作用和药物在体内的行为的关键领域。
药效学研究药物对细菌的杀菌能力和抑菌效果，而药动学研究药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄等过程。
药效学和药动学参数能够帮助我们评估抗菌药物的治疗效果和合理使用。
药效学参数包括最低抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）、抑菌比例（MIC_50/MIC_90）等。
MIC是指抑菌药物抑制细菌生长的最低浓度，常用于评估药物的抗菌效果。
MBC则是指抑菌药物杀灭细菌的最低浓度，能够评估药物的杀菌能力。
抑菌比例是指在一定的药物浓度下，对特定细菌菌株的抑菌效果的百分比。
药效学参数能够帮助我们了解药物抗菌活性的大小以及对不同细菌菌株的抑制和杀灭能力。
药动学参数包括最大药物浓度（C_max）、最低药物浓度（C_min）、药物半衰期（t_1/2）等。
C_max是指药物在给药后体内达到的最高浓度，而C_min则是指药物在给药后体内的最低浓度。
药物的C_max和C_min对于抗菌药物来说十分重要，因为这些参数与药物的疗效和安全性密切相关。
药物的半衰期是指药物在体内减少一半所需的时间，能够帮助我们确定药物的给药频率和剂量。
此外，还有一些与药物抗菌活性和体内行为相关的参数，如药物的生物利用度（bioavailability）、药物的分布容积（V_d）和清除率（clearance）等。
生物利用度是指药物从给药后到进入循环系统的比例，主要反映药物的吸收过程。
药物的分布容积是指药物在体内分布的情况，能够帮助我们判断药物在细胞内和细胞外的浓度差异。
药物的清除率是指单位时间内机体清除药物的能力，能够帮助我们确定药物的排泄速率和剂量调整。
综上所述，抗菌药物的药效学和药动学参数是评估药物治疗效果和合理使用的重要指标。
了解这些参数可以帮助临床医生和药师选择合适的抗菌药物，并确保药物在体内的浓度能够达到有效抑菌或杀菌水平，以提高抗菌治疗的成功率。
抗菌和抑菌效果评价方法
抗菌和抑菌效果评价方法引言：随着抗生素的广泛应用和细菌耐药性的不断增强，对抗菌和抑菌效果评价方法的研究变得越来越重要。
本文将介绍几种常用的抗菌和抑菌效果评价方法，以期为相关研究提供参考。
一、最小抑菌浓度（MIC）最小抑菌浓度是指抑制细菌生长所需的最低药物浓度。
常用的MIC 测定方法有两种：管法和板法。
管法采用不同浓度的抗生素溶液与细菌进行反应，观察细菌生长情况以确定最小抑菌浓度。
板法则是将抗生素涂于琼脂培养基上，再将细菌接种于上面，通过观察细菌生长情况来确定最小抑菌浓度。
这两种方法都具有操作简单、结果可靠的特点，被广泛应用于抗菌药物的研究和临床应用。
二、抗菌圈直径法抗菌圈直径法是通过测量药物在琼脂培养基上抑制细菌生长所形成的抗菌圈直径来评价抗菌效果的方法。
该方法适用于各种抗菌药物的评价，操作简单、结果直观，广泛应用于实验室和临床。
通过测量抗菌圈直径，可以判断药物对细菌的抑制程度，进而评估其抗菌效果。
三、抑菌率法抑菌率法是通过将不同浓度的抗生素溶液与细菌进行反应，然后观察细菌生长情况，计算抑菌率来评价抑菌效果的方法。
抑菌率是指抑制细菌生长的百分比，通常使用百分比作为评价指标。
抑菌率法可以较直观地反映药物对细菌的抑制能力，但其结果受到实验条件和操作方法的影响，需要注意标准化实验条件以确保结果的准确性。
四、细菌存活率法细菌存活率法是通过测量抗生素处理后细菌存活的比例来评价抗菌效果的方法。
常用的方法有平板计数法和浊度法。
平板计数法是将处理后的细菌溶液均匀涂布于琼脂平板上，经过一段时间后，计算细菌的存活率。
浊度法则是通过测量细菌溶液的光学密度来评估细菌存活率。
这两种方法都可以较准确地评估抗菌效果，但需要注意操作的严谨性和结果的可靠性。
五、细菌增殖曲线法细菌增殖曲线法是通过测量细菌在不同浓度抗生素处理条件下的生长曲线来评价抗菌效果的方法。
该方法可以直观地反映药物对细菌生长的抑制程度，并且可以确定最佳抑菌浓度。
抗生素最低抑菌浓度
抗生素最低抑菌浓度（MIC）和半数抑菌浓度（MIC）测定方法几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法：1.1.常量肉汤稀释法1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。
二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
最低抑菌浓度测定方法
2.1.8 抗（抑）菌试验2.1.8.1 目的测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。
常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞留抑菌效果测定试验、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验，可视情况选用。
2.1.8.2 抑菌环试验2.1.8.2.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。
试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。
本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
2.1.8.2.2 试验器材(1)金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(A TCC 10231) 菌悬液(见2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。
(2)抑菌剂载体(5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120℃烤干2h，保存备用)。
(3)活菌培养计数所需器材(见2.1.1.3)。
(4)微量移液器(5μl～50μl，可调式)。
(5)游标卡尺。
(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基2.1.8.2.3 操作程序(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。
每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液20μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃) 中烤干，或置室温下自然干燥后备用。
溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为5mm，厚不超过4mm圆片(块)，每4 片(块) 一组。
(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水20μl，干燥后备用。
溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片(块)。
(3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。
每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。
抗菌性能的测定
• 采用微量加样器向各试管均加入制备好的 菌悬液0.2 μL, 摇匀后放入孵箱中37 °C 培 养24 h. 取出观察细菌生长情况. • 3.最小杀菌浓度(MBC)测定： • 从样品浓度高于MIC值(包括MIC浓度)的试管 中各吸取100 μL分别滴到灭菌的琼脂平板上, 涂布均匀, 在孵箱中37 °C培养24 h. 肉眼观 察实验结果。
• 4.实验结果： • (1).在对照管中细菌呈混浊状生长; 然后观察 含有不同浓度Ag纳米颗粒的各试管中溶液 的混浊度, 溶液开始出现澄清的最低浓度确 定为样品的MIC值. • (2).菌落数小于5 个或无菌落生长的最低样 品浓度确定为MBC值.
• (3). 实验表明PVP 修饰Ag 纳米颗粒最小抑菌浓度分 别只有3.9 和7.8 μg·mL-1, 与商品抗菌剂的值(约800 μg·mL-1)相比均要低得多,这表明PVP 修饰Ag纳米颗 粒在很低浓度下就表现出抑菌性能. • (4).最低杀菌浓度也比文献报道的水溶性Ag 纳米颗 粒的MBC值(120 μg·mL-1)小,表明其杀菌性能较好. • (5). S.aureus 和E. coli 分属于革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌, 所制备的PVP 修饰Ag 纳米颗粒对它们均有 较好的抑菌和杀菌性能, 这说明样品具有一定的广 谱抗菌性.
• (6).随着纳米银浓度降低，抑菌作用逐渐降 低。但是在最大的稀释度下，其抑菌率都 能达到90%以上。（如图）
பைடு நூலகம்
• (7).另有实验表明，PVP修饰的Ag纳米颗粒 对于牛奶、馒头、西瓜等食物在适当的时 间内均有较好的抗菌性能。
抗菌性能的测定
• 通过检测最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC) 评价所制备PVP 修饰Ag 纳米颗粒的抗菌性能。 • 1.制备菌悬液： • 取4 °C 保存的菌种（菌株大肠杆菌(E. coli)、金黄色 aureus) 葡萄球菌(S. aureus)）接种于牛肉膏蛋白胨培养 • 基, 放入37 °C孵箱中培养18 h; 然后取该增菌培养 • 物, 再接种于牛肉膏蛋白胨培养基中, 仍置于37 °C • 孵箱中培养6 h, 即制成含有一定菌落浓度的培养 • 物. 将一定量培养物加到无菌试管中, 用无菌生理盐 • 水调配成含菌量约为107 colony-forming units (cfu)/ • mL的菌悬液, 菌落计数采用显微镜直接计数法.
抑菌试验
抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1.常量肉汤稀释法抗菌药物贮存液制备1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
药敏试验用抗菌药物浓度范围1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
培养基1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
接种物的制备1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
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抑菌圈法测量抑菌活性
1．无菌条件下取保存于-80℃的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、李氏杆菌、猪丹毒、植物乳酸菌、戊糖乳酸杆菌菌种划线于固体琼脂平板上，37℃培养，挑取单个菌落，连续传代2次，保存备用。
2．取活化后的不同菌种接种于相应的培养基中，其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌接种于LB培养基中，37℃摇床培养至对数生长期。
链球菌、李氏杆菌、猪丹毒、巴斯杆菌接种于LB培养基中(加入5%的血清)，37℃摇床培养至对数生长期。
植物乳酸菌和戊糖乳杆菌接种于MRS培养基中，37℃静置培养至对数生长期。
3．取对数生长期的各种细菌10 μL加入到1mL相应的培养基中混匀，涂于琼脂平板，待菌液稍干后，在每个平板中放入2个牛津杯，其中一个牛津杯中加入200 μL复性超滤浓缩的1 mg/mL重组蛋白，另一个牛津杯中加入最后一次透析液作为对照，每种菌做三个重复。
4．将琼脂平板放入37℃温箱中培养，细菌长满平板后用镊子小心的取出牛津杯，测量清晰地抑菌圈直径。
2.2.9.2 最小抑菌浓度测定(MIC)
1．菌悬液制备：取2.2.8.1中活化的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、李氏杆菌10uL接种于相应的5mL培养基中，37℃摇床培养至对数生长期。
2．平板活菌计数：用生理盐水将培养至对数生长期的各种细菌做10倍比稀释，混匀后选择10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10六个稀释度接种平板，每个稀释度做三个重复，每板接种100uL，并将之在平板上涂布均匀，37℃培养16 h，选择菌落数在30至300的稀释度，计算其菌落数的平均值，并按其稀释倍数计算出培养液中的活菌数量。
3．乳铁蛋白溶液的制备：将2.2.7.2方法中复性的蛋白进行超滤浓缩，并用2.2.7.3方法进行蛋白浓度的测定，使其终浓度达到4mg/mL。
4．乳铁蛋白对各种细菌的MIC值：取灭菌的干净离心管25支，分成五组，每组5个，编号1～5，将五种细菌培养至对数生长期，再将其稀释至105/mL，每个离心管中加入0.5 mL。
再向每组的第一个离心管中加入0.5 mL浓度为4mg/mL的猪乳铁蛋白制备液，混匀后取0.5 mL加入到第二个离心管中，同样的方法一直稀释到第五个离心管中，1～5管中重组蛋白的浓度分别2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL，37℃作用18 h，观察结果，以无细菌生长的最低浓度为MIC值。