实验一 蛋白质的定量测定 Lowry法
Lowry法检测蛋白质含量
Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
实验一蛋白质的定量测定
蒸馏水(ml)
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
Fo1in-酚试剂甲(ml)
5
5
5
5
5
5
5
摇匀，室温下放置10分钟
Fo1in-酚试剂乙(ml)
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白， 在500nm处比色
A500
各管加入Fo1in-酚试剂乙后，立即摇 匀，放置30分钟后比色，在500nm处 记下各管光密度，以0号管为对照，以 光密度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
01
测定未知样品：
02
取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加5毫升
Fo1in-酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫
1
进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波 长：若蛋白质含量高时（25-100μg）在500nm波长处 进行测定，含量低时(5-25μg)在755nm波长处进行测 定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白 质的含量。
2
此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备， 灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵 敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以 稳定几个小时。
试剂乙： 称钨酸钠（Na2WO2•2H2O）100g，钼酸钠
（Na2MoO4•2H2O）25g置2000ml磨口回流装置内， 加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充 分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小 玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4） 150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸 15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过 滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带 任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存 液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分 钟，恢复原色仍可继续使用。 试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢 氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液 颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂 的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸 度应用。
蛋白质检测(Lowry)--方法学验证
Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。
2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。
4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。
0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。
0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。
0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。
酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。
3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。
生化实验：Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
试剂乙
深蓝色
(Folin试剂)
实验步骤
1．样品的稀释：准确取血清0.1ml (擦 慢 吹) ，置
于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，倒置摇匀。 2．取玻璃试管7支，
表1 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定血清蛋白质含量的测定步骤
3
实验结果
1 各管吸光值记录 2 制作标准曲线（坐标纸做，贴于实验报
Folin-酚试剂法（Lowry法）测 定蛋白质浓度
1
实验目的
1. 掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理及操作。 2. 掌握标准曲线的制作方法。
实验原理
碱性铜试剂 试剂甲
蛋白质（肽键）
铜-蛋白质络合物（双缩脲反应）
-CO-NH-
紫红色
铜-蛋白质络合物（酪氨酸，色氨酸）
磷钼酸-磷钨酸
磷钼蓝 + 磷钨蓝
标注于图中 文字说明：利用标准曲线求得待测蛋白浓度值
3 利用公式法求出待测蛋白浓度
4
实验讨论与分析 实验结论 思考题：绘制标准曲线的意义及制作注
意事项？
5
lowrry法检测蛋白质含量.
Lowry法测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定，可检测的最低蛋白质量达5μg，通常测定范围是20~250μg。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂（1）酚试剂（2）碱性铜溶液：摇匀，即得。
本液应临用配制。
标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支，用超纯水定量稀释至1mg/ml，作为贮备液。
精密量取贮备液1.0ml置10ml离心管中，用超纯水稀释至10ml，摇匀，即为100μg/ml 的标准蛋白质溶液。
测定法准确量取超纯水1.0 ml，作空白对照。
精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中，加超纯水至1.0 ml；精密量取一定体积供试品（含蛋白质50μg左右）置试管内，样品1α-IFN，分别取50ul和30ul，加超纯水至1.0 ml，稀释20倍和33.3倍；精密量取一定体积供试品2（含蛋白质50μg左右）置试管内，实验室样品2，分别取100ul和200ul，加超纯水至1.0 ml，稀释10倍和5倍；每管都加入碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟；快速加入酚试剂0.5ml，马上摇匀，室温放置8分钟，显色后，照紫外-见分光光度法，在波长650nm 处测定吸光度。
结果如下：以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。
方程：y=0.0023x + 0.0261 R2 =0.9961样品1α-IFN：7号管，稀释20倍，OD值0.163，经计算x = 59.52μg/ml，样品蛋白浓度为1.190 mg/ml。
8号管，稀释33.3倍，OD值0.110，经计算x = 36.48μg/ml，样品蛋白浓度为1.216 mg/ml。
则样品1 α-IFN的蛋白浓度为1.203mg/ml。
Lowry’s法(Folin-酚试剂法)测定蛋白含量
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2021/8/2
原理
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白 质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标 准液比色即可求出蛋白质的含量。
即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品 中蛋白质的含量。
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血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
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2021/8/2
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
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2021/8/2
即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与 碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白 质- Cu2+复合物。
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2021/8/2
原理
第二步：Folin-酚显色反应
Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其 磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈 蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质 中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显 色反应。
– 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则 第1支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟 后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加 第3支试管，以此类推。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
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2021/8/2
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
实验一蛋白质的定量测定
实验一蛋白质的定量测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。
在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA 法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。
例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA 法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较测定范围（μ 不同种类最大吸收波方法特点g/ml）蛋白的差异长nm 标准方法，准确，操作麻烦，费时，凯氏定氮法小灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物100—1000 大280205 度法质有影响重复性、线性关系好，灵敏度低，测双缩脲法1000—10000 小540 定范围窄，样品需要量大Folin-酚试20—500 大750 灵敏，费时较长，干扰物质多剂法考马氏亮蓝灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会50—500 大595 G-250 转移灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时BCA 50—500 大562 较长由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250 染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
Lowry法检测蛋白质含量
Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
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1、 熟悉改良Lowry法测定血清蛋白质含量的原理。
2 、掌握直接比色法和标准曲线法的应用。
3 、熟悉分光光度计的使用。
二、 实验原理
考马斯亮蓝法 紫外分光光度法 Lowry法
二、 实验原理
蛋白质
碱性铜试剂
肽键
酪氨酸、色氨酸等 紫红色蛋白质-铜的络合物 氨基酸残基
酚试剂
蓝紫色溶液
碱性铜试剂
5.0
混匀，37℃ 保温20 分钟 酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀，37℃ 保温3
直接比色法：根据标准管吸光度值计算血清中蛋白质 的含量
标准曲线法：绘制标准曲线，根据标准曲线求得血清 中蛋白质的含量
A=KLC
直接比色法
标准曲线法
三、 实验步骤
试剂（ml） 标准蛋白溶液
（250μg/ml）
1
2
3
4
5
6
测 定 管
稀释血清
标 准 管
空 白 管
1.0
5.0
0.2 0.8
5.0
0.4 0.6
5.0
0.6 0.4
5.0
0.8 0.2
5.0
1.0 5.0
1.0
0.4 0.6
5.0
1.0
5.0
0.9% NaCl