拟南芥中一个参与盐胁迫应答基因的T-DNA插入纯合突变体的鉴定及表型分析
拟南芥ABI3基因缺失突变体的鉴定及对盐胁迫的响应
拟南芥ABI3基因缺失突变体的鉴定及对盐胁迫的响应赵彦敏;高海琴;瓮巧云【摘要】采用PCR和RT-PCR技术分别在DNA和RNA水平上对由于T-DNA 插入所导致的拟南芥ABI3基因突变体进行鉴定,鉴定后将野生型Col-0与纯合abi3突变体种子分别置于含不同浓度NaCl的MS培养基上培养,测定萌发率、生物量和根长.结果表明:在NaCl胁迫下,野生型Col-0和纯合abi3突变体种子的萌发率、生物量和根长均随着NaCl浓度的增加呈现下降趋势.在相同NaCl浓度下,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均低于野生型Col-0.当NaCl浓度达到150 mmol/L时,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均降到最低,与野生型Col-0存在极显著差异.可见,拟南芥ABI3基因具有提高拟南芥抗NaCl 胁迫能力的作用.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2018(034)004【总页数】4页(P7-10)【关键词】ABI3基因;T-DNA插入;突变体;NaCl胁迫【作者】赵彦敏;高海琴;瓮巧云【作者单位】张家口广播电视大学,张家口075000;张家口广播电视大学,张家口075000;河北北方学院农林科技学院,张家口075000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2植物在生长发育过程中,不可避免地会受到各种非生物因素如干旱、低温、高盐及高温等的胁迫,导致农作物的生长品质及产量下降。
作为植物体内重要的逆境响应激素之一,脱落酸(Abscisic acid,ABA)既是胁迫的诱导产物,又是胁迫信号的传导者,通过级联放大反应,能迅速参与到植物抗胁迫的反应中。
此外,脱落酸还参与植物生长的其他环节,如能促使马铃薯形成块茎、抑制种子的萌发等。
早期通过正向遗传学方法筛选到一些在萌发率上对 ABA不敏感的拟南芥基因,如 ABI1-1、ABI2-1、ABI3、ABI4和ABI5[1-4];作为ABA信号的正调控转录因子ABI3基因,在植物的抗旱性和耐盐性功能中起重要的作用[5],主要在种子里表达[2]。
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥T-DNA插入突变
Virulence proteins recognise the border sequences (LB、RB)that define the T-DNA.
a
12
（3）筛选纯和合突变体 实1、验实方验案方设案计设计
• 1.确定所要研究的基因 通过生物信息学的方法推测出一些可能具 有赤霉素糖基转移酶的基因。
• 2.获得种子 进入如下网站/index.jsp，输入
种子基因型号。
a
13
（3）筛选纯和 合突变体
实验方案设计
a
6
2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术
the mechanism of T-DNA insertion
• In the plant cell, the T-DNA is coated with the single-stranded DNA-binding protein, VirE2.
•
在多个生长阶段发挥作用的基因，其突变可能导致早期胚 致死效应，因而也无法鉴定。
• 瞬间表达的基因、低水平表达的基因，以及在少数细胞中 表达的基因，都很难用基因敲除突变体鉴定。
（Patrick J. Krysan et al，1999 ）
（赵霞，周波等，2009）
a
33
（4）表型鉴定
表型鉴定应对策略
a
11
• 目前已经完成测序的植物有三种：拟南芥 、水稻、毛果杨(Populus trichocarpa)。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变体鉴定
拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变体鉴定徐文晶;程玉祥【摘要】To explore information and physiological function of nucleoside phosphorylase genes,by using PCR method,the authors examined gene expression of nucleoside phosphorylase in different tissues of model plant arabidopsis, and further screened T-DNA-inserted mutants of these genes. Results:Transcriptional expression of At4g28940 and At4g28940 is high in root tissues ,and slight transcript levels are detected in other tissues ,while At4g24350 gene expression is low in various tissues .After the identification of T-DNA insertion and transcriptional levels of thegenes ,the knockout mutants of At4 g28940 and At4 g24350 have been attained in this study .%为探明植物核苷磷酸化酶家族基因信息及生理功能，采用 PCR 扩增的方法，研究了模式植物拟南芥核苷磷酸化酶家族基因在不同组织中的表达，并对其核苷磷酸化酶基因 T-DNA 插入突变体进行鉴定。
结果表明：At4g24340和 At4g28940基因在根组织中大量转录表达，其他组织均微量检测到转录表达；At4g24350在各个组织中均有少量转录表达；经 T-DNA 插入结合转录表达鉴定，At4g28940和 At 4g24350基因为敲除突变体。
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。
，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。
同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。
借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。
以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。
由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3
拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察
ＰＣＲ ｄ ｎ ｉｉａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｐｈ ｎ ｔ ｐ ｃ Ｏｂ ｅ ｖ ｔｏ ｆａ ｃ ｉ ｖ Ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ｎ ｅ ｏ ｙ ｉ ｓ ｒ ａ ｉ ｎ ｏ ｔｗ ｎ ｌ Ｇｅ ｅ Ｔ— ｎ ＤＮＡ ｎ ｅ ｔｏ ａ ｕ ａ ｔｏ ｒ ｂ ｄｏ ｉ Ｉ ｓ ｒ ｉ ｎ ｌＭ ｔ ｎ ｆＡ ａ ｉ ｐｓｓ
ｕ ｅ ｏ ｃ ｍ ｐａ ｅ ｐ ａ ｓ ｄ ｔ ｏ ｒ ｌ ｎｔｍｏｒ ｈｏｌ ｉ ａ ｉｆ ｒ ｎｃ ｓ ｉ ｈｅ ｐｅ ｉ ｇｅ ａ ｉ ｅ ｇ ｏｗｔ ｎｄ ｒ ｐｒ ｄｕｃ ｐ ｏｇ ｃ ｌｄ ｆ ｅ ｅ ｅ ｎ ｔ ｒｏｄ ｏｆｖｅ ｔ ｔｖ ｒ ｈ ａ ｅ ｏ — ｔｖ ｏ ｈ． ｉ ｅ ｇｒ ｗｔ Ｔｈｅｒ ｓ ｔ ｈ ｅ ｕｌｓ ｓ ｏｗｅ ｈａ ｏ ｐ ｒ ｄ ｔ ｈｅ ｗｉｄ ｔ ｐｅ ｔ ｒ ｉ ａ ｉ ｎ ｒ ｔ ｆａｔｗｉ ｌ ｄ ｔ ｔｃ ｍ ａ ｅ ｏ ｔ ｌ ｙ ｈｅ ｇｅ ｍ ｎ ｔｏ ａ ｅ ｏ ｃ ｎｖ ａ ｅ ａ ｅ ｙ ｄｅ ｒ ａ ｅ ５ ｖ ｒ ｇ ｌ ｃ ｅ ｓ ｄ ｂｙ ．８８ ｐｅ ｃ ｎｔ ｇｅ ｐ ｎ ｓ； ｏｍｐａ ｅ ｏ ｈ ｗｉｄ ｔ ｅ， ｌｉ ｉ ｅ ｆ ａｒ－ ｒ ｅ ａ ｏｉ ｔ ｃ ｒ ｄ ｔ ｔ ｅ ｌ ｙｐ ｂｏ ｔｎｇ ｔｍ ｏ ｃ
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００２）；中央高校基本科研业务费（２０１１ＳＣＵｌｌｌ０７）
万方数据 杨毅．Ｅ ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５ ２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｉｎ
赵成（１ ９８６）男，四川成都人，硕士，研究方向为植物遗传与分子生物学．Ｅ ｍａｉｌ：４９８６１２９０６＠ｑｑ．ｃｏｉｎ
四川大学学报（自然科学版）
第５１卷
１
引
言
２０１４年５月 第５１卷 第３期
四川大学学报（自然科学版）
Ｓｉｃｈｕａｎ
Ｍａｙ．２０１４
Ｖ０１．５１
Ｎｏ．３
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０
６７５６．２０１４．０３．３７
拟南芥中一个参与盐胁迫应答基因的Ｔ—ＤＮＡ 插入纯合突变体的鉴定及表型分析
型种子为本实验室保存．突变体种子为从拟南芥 生物资源中心（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅ
３７）与ｄｎ（５－ＴＣＴＧＴＧＡＴＴＣＧＧＡＣＣＴＴＡ ３７），
ｂｐ．
其产物长度为４６２
２．２．４
万方数据 Ｃｅｎｔｒｅ，ＡＢＲＣ）购买的编号为ＳＡＬＫ
１４８１８２Ｃ拟
Ｎａｃｔ处理条件下野生型与突变体种子的
（５－ＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＡ ３ ７）和（５，＿ ＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＡ
３７）．扩增产
物用１．０％的琼脂糖凝胶电泳分析．
２．２．３
半定量分析野生型拟南芥在非生物胁迫下 将若干饱满的拟南芥种子在４℃春
的表达情况
化４ｄ，然后用升汞（ｏ．１％）消毒ｉ０ ｒａｉｎ，７５％乙醇 灭菌３０ Ｓ，然后用无菌水将种子洗涤５次，将种子 播种于ＭＳ培养基平板上，在ＭＳ平板上生长七 天后，将拟南芥幼苗分别移至经ＭＳ，ＭＳ＋ｉ０％
的引
物
ＬＢ
（５
。ＴＣＡＡＡＣＡＧ
ＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴ
３７）一ＮＡ试剂盒 提取突变体幼苗ＲＮＡ，将其反转录为ｃＤＮＡ，用
ＲＴ
ＰＣＲ分析其转录水平，得到的ｃＤＮＡ用突变
基因ａｔＳ９６６０７０的特异引物ＬＰ与ＲＰ进行扩增， 同时以ａｃｔｉｎ基因表达为对照，ａｃｔｉｎ基因引物为
Ａ
将种子洗５次，将种子播种于ＭＳ，ＭＳ＋１００
ｍＭＮａＣｌ，ＭＳ＋１５０ ｍＭＮａＣｌ培养基平板上，观
里Ａ ＡＴＧ—■■●—●■■●１■■■■ｌ＿＿１■｜ＴＧＡ
察野生型与突变体株系的萌发情况，实验重复３ 次，每个株系的播种数目均为１００颗．
２．２．５
Ｂ
ＮａＣｌ处理条件下野生型与突变体的根长
分析用同样的方法春化野生型与突变体种子， 并消毒．将种子播种于ＭＳ平板上，在ＭＳ平板生 长两天后，分别将野生型与突变体幼苗移苗至ＭＳ
ＤＮＡ
插入纯合突变体．分析了野生型拟南芥与突变体在不同浓度ＮａＣｌ处理下，其萌发率，根长以 及苗期的生长差异．结果发现，相对于野生型来说，突变体对盐更敏感．具体来说，在含有 １５０ｍＭＮａＣｌ的Ｍｓ培养基中，突变体的萌发率比野生型要低，根长比野生型要短，同时突变 体幼苗更容易出现枯萎，萎黄症状． 关键词：拟南芥；盐胁迫；幼苗生长；ａｔ５９６６０７０；萌发率 中图分类号：Ｑ３７ 文献标识码：Ａ
２．２．２
土地盐渍化是指由于自然因素和人为不合理 的措施而引起的土壤盐渍化．比如说由于蓄水工 程使得蓄水区域变成了水面，拦截了径流，减少 了下游水量，增加了水面蒸发，并且使库区周围 地下水位上升，导致了土壤盐渍化．土壤盐渍化 是一个世界性问题，严重影响着农业生产和经济 发展，选育和培育耐盐植物品种适应盐渍环境， 是缓解土壤盐渍化对农业生产影响的最经济有效 的方法口０。”］．据统计，我国现有耕地中，至少有 ８００万ｈｍ２的土地由于不当的灌溉和施肥，导致土 壤中盐分积累，严重影响了农作物的产量． 大量研究表明，植物对盐胁迫环境的应答反 应涉及了多种基因和复杂的途径，盐分对植物最 普遍和最显著的效应就是植物抑制生长［１，…．因此 通过分子生物学的手段研究耐盐基因显得非常的 重要［５］．根据前人的大量研究表明，发现含有 ＲＩＮＧ结构的基因与植物抗逆性关系密切［４］．比 如，含有ＲＩＮＧ结构的ＲＧＬＧ２基因对拟南芥的 干旱胁迫具有负调控作用［６］，ＤＲＥＢ２Ａ是含有 ＲＩＮＧ结构的一个基因，它编码的蛋白与其它蛋 白相互作用，对拟南芥的干旱胁迫具有负调控作 用口］，ＲＨＡ２ａ是含有ＲＩＮＧ结构的一个基因，在 种子萌发于以及幼苗的生长阶段起作用，在盐胁 迫与干旱胁迫下以及对ＡＢＡ的响应起到正调控 的作用口］．本课题研究拟南芥中未知基因 ａｔＳ９６６０７０在其Ｃ端有一个保守的ＲＩＮＧ结构， 分析了该基因在受到各种非生物胁迫后，基因的 表达情况，发现该基因在盐胁迫下，表达量明显 升高．然后以ＮａＣｌ作为盐胁迫因子口，…，探讨其 对野生型及突变体拟南芥生长的影响．研究结果 发现，在盐胁迫条件下，突变体种子萌发率明显 低于野生型，并且根长也比野生型要短一些，同 时，在幼苗的生长过程中，突变体幼苗更容易出 现萎黄，枯萎的症状．这些结果说明该基因可能 参与拟南芥中盐胁迫信号通路．
ａｔ ｓｔｒｅｓｓ
ｏｎ
ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｎｄ．Ｏｎｅ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ Ｔ ＤＮＡ ｍｕｔａｎｔ
ｒａｔｅ，ｒｏｏｔ
ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ ＰＣＲ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｌｅｎｇｔｈ
ａｎｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＮａＣｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｉＳ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ＇ｓ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
第３期
赵成等，拟南芥中一个参与盐胁迫应答的基因的Ｔ ＤＮＡ插入纯合突变体的鉴定及表型分析
６１７
萌发分析选取若干同一时期播种，同一时期收 集的饱满，圆润，大小一致的野生型拟南芥种子 与突变体种子在４℃春化４ ｄ，然后用升汞（ｏ．１％）
消毒１０ ｒａｉｎ，７５％乙醇灭菌３０ Ｓ，然后用无菌水
ＡＢＡ处理后的条带与野生型中的差异不大，而在 ＮａＧｌ处理下，扩增的条带亮度远大于野生型．
＋１００ ｍＭＮａＣｌ，ＭＳ＋１５０
ＥＦ
ｃｏｌ ｍｕｔ Ｃ
ｍＭＮａＣｌ培养基平板
｛沁
上，倒立放置培养，每天观察根长生长情况，并记
录，７ ｄ后拍照，实验重复３次．
２．２．６
蚍一一～
ＮａＣｌ处理条件下野生型与突变体的苗期
飞钆上定久
ｍ
ｋ仆 野
ｕ
生长状况分析 用同样的方法春化野生型与突变体种子，并消 毒．将种子播种于ＭＳ平板，在ＭＳ平板生长七天后， 分别将野生型与突变体幼苗移苗至ＭＳ＋１５０ｍＭＮａＣｌ 培养基平板上，在组织培养室中培养两周，观察苗期 生长情况，两周后拍照，实验重复３次．
外显子处（图１，ａ）．在ＤＮＡ水平上，用基因的两 端引物ＬＰ与ＲＰ扩增后，野生型中有一条带，与 此对应的突变体中没有条带，当用ＲＰ与ＬＢ一起 扩增时突变体中有一条特异条带．而野生型中没 有出现条带，其中ｃｏｌ表示野生型，ｍｕｔ表示突变 体（图１，ｂ）．而在转录水平上，用基因特异的引 物，野生型中能够扩增出预期大小的条带，但在 突变体中没有（图１，ｃ），表明Ｔ ＤＮＡ的插入使得 突变体中ＡｔＳ９６６０７０基因完全被敲除，这一株材 料是ＡｔＳ９６６０７０基因缺失的纯合突变体，供后续 实验使用．
ｈ，
突变体纯合子鉴定
ＤＮＡ水平检测：突
变体幼苗在培养箱中生长１个月后，提取叶片总 ＤＮＡ，以所提取的总ＤＮＡ为模板，采用三引物 ＰＣＲ法，进行ＰＣＲ扩增．Ａｔ５９６６０７０基因特异的
引物ＬＰ（５－ＣＡＴＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＴＣ
７），ＲＰ（５
Ｔ ＤＮＡ ３
ＣＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＣＣＡＧＡＧＴＣＡＧ ３）７与
Ｓｕｃｒｏｓｅ，Ｍｓ＋３００ ｍＭ Ｍａｎｎｉｔｏｌ，Ｍｓ＋１０ ｔ＊Ｍ
ｈ，
２材料和方法
２．１
ＡＢＡ，及ＭＳ＋２５０ ｍＭＮａＣｌ的平板上处理８
用天根ＲＮＡ提取试剂盒分别提取ＲＮＡ，用ＲＴ ＰＣＲ分析目的基因在几种处理下的表达情况．半 定量所用引物为ｕｐ（５－ＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＴ
ＧＧ
实验材料 拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态
ｒａｔｅ ｔｏ
ｓａｌｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｔｏ
ｔｈｅ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ．
ｉｓ １０ｗｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｏｔ １ｅｎｇｔｈｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｒｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｗｔ
ｔｏ
Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，
ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｐｒｏｎｅ
ｂｅ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ
３．２
３．３野生型与突变体在ＮａＣＩ胁迫下的萌发情况 在正常ＭＳ培养基下，春化４ｄ后的野生型与 突变体的萌发率基本一致，在第３ｄ即可看到有 ９０％以上的种子萌发，第６ｄ时，均完全萌发．而 在含有１００ｍＭ ＮａＣｌ的ＭＳ平板上，突变体相比 于野生型萌发率要低，第六天时野生型的终萌发 率为９０％，突变体仅为７８％．在１５０ｍＭ ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上，这种影响更大，野生型的终萌发率为 ５１％，突变体仅为２３％，见图３．
赵 成，杨
昊，刘志斌，杨
毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘
要：本研究以拟南芥为试验材料，探索基因ａｔＳ９６６０７０在受到非生物胁迫的表达情况，
并研究其抗逆特性．结果表明，在ＮａＣｌ处理下，该基因的表达量明显升高，表明该基因受到 盐的诱导．通过ＰＣＲ和ＲＴ ＰＣＲ在ＤＮＡ和ＲＮＡ水平上筛选鉴定ａｔＳ９６６０７０基因Ｔ