反硝化微生物分子生态学技术及相关研究进展

成为北京地区地下水两种主要污染物之一
[ 6]
。中国
农业科学院在北京、山东、陕西、河北、天津等地 20 个县 600 多 个点位的抽样调查 显示, 在北 方集 约化 的 高 肥 用 量 地 区 20% 地 下 水 硝 酸 盐 含 量 ( NO3- ) 超过 89 mg #L50 mg #L #L1[ 7] - 1 1
( 中5% 地下水硝酸盐含量 (
-
) 超过
( 主要发达国家饮用水硝酸盐含量限量
标准 ) , 个别地点硝酸盐含量 ( NO3 ) 超过 500 mg , 地下水 硝酸盐污染将 对上亿人口的 饮用 水质量安全造成威胁。我国农田反硝化脱氮损失严 重, 研究数据表明我国农田化肥氮素通过不同损失 途径进入环境的氮量每年约为 1 300 万 t , 其中进 入地表水 125 万 t, 进入地下水 50 万 t, 硝化和反 硝化损失 850 万 t, 氨挥发损失 275 万 t ( 朱兆良 , 私人通讯) 。这些氮素成为地表水富营养化 , 地下 水硝酸 盐富 集, 以 及大 气 N2 O 的主 要来 源之一 , 已受到世界关注。稻田氮循环研究表明由反硝化微 生物所引起的反硝化作用是土壤、湿地中氮素流失 的主要原因, 以分子态氮气进入大气。 2 研究环境反硝化微生物的分子生态学方法 反硝化微生物是一个生理类群 , 广泛分布于土 壤、淤泥、水体等自然环境。在分类单元上主要分 布 在 Pseudomonaceae 、 Neisseriaceae 、 Nitrobacteraceae 、 Rhodospirillaceae 、 Bacillaceae 、 Cytophagaceae 、 Spirileaceaee 、 Rhizobiaceae 、Halobacteriaceae 等科[ 8] 。 传统理论认为反硝化微生物均为细菌, 在嫌气条件 下进行反硝化作用。 1991 年 Shoun 等发现 Fusarium oxysporum 在厌氧条件下可以把硝酸盐和亚硝 酸盐 还原成 N2O, 从而打破了这一传统观念[ 9] 。后来发 现反硝化过程广泛存在于真菌的半知菌纲、子囊菌 纲和担子菌纲; 很多放线菌 Frankia 属
中国土壤与肥料
2007( 2)
反硝化微生物分子生态学技术及相关研究进展
孙建光1, 2 , 高俊莲3 , 马晓彤1, 2 , 徐 晶1, 2 , 姜瑞波1, 2 100081; 100081; 100089) ( 11 农业部植物营养与养分循环重点实验室, 北京 21 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所, 北京 31 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心, 北京
反硝化在传统意义上被定义为某些细菌在无氧 或微氧条件下以 NO
3-
或 NO
2-
作为电子受体进行呼 或 NO2- 还原为 N2O
反硝化作用是自然界江河湖海实现自体净化的主要 途径。治理地下水硝酸盐污染关键在于治理地表水 的氮素富营养化, 最有效的途径之一是通过微生物 反硝化脱氮。研究我国江河湖泊以及农田反硝化微 生物, 对治理水环境污染、改善我国城镇居民饮用 水质量、以及减少农田氮肥损失具有重要意义。 1 我国的水体富营养污染、 农田氮肥损失及其与 反硝化微生物的密切关系 我国的江河湖海水体富营养化严重, 水环境治 理耗资巨大。 20 世纪 70 年代以来, 随着我国人口 的迅速膨胀 , 农业集约化程度的高速增长 , 我国许 多地区的湖泊、河流和近海海域都出现了不同程度 的污染 , 水体的氮素富营养化问题急剧恶化[ 2] 。太 湖、巢湖已进入富营养化状态, 水质总氮指标等级 已达劣五类[ 3] 。洪泽湖、洞庭湖、鄱阳湖和一些主 要的河流水域如淮河、汉江、珠江、葛洲坝水库、 三峡库区也同样面临着富营养化的威胁。根据世界 银行和中国有关专家的研究 , 水污染在中国造成的 经济损失约占 GDP 的 11 46% ~ 2184% [ 4] , / 十五0 期间用于包括水污染治理的环境整治的投资规划为 7 000 亿元 , 已达到中国 GDP 的 1% [ 5] 。城市地下 水是重要的饮用水资源 , 目前地下水硝酸盐污染已 经对城市的饮用水安全造 成了威胁。如北京市约 50% 饮用水资源取自 地下水, 据 北京市环 保局对 ) 7 )
中国土壤与肥料
2007( 2) 用反转录 PCR ( RT - PCR, reverse transcription PCR) 技术分析亚硝酸还原酶 nirK 和 nirS 基因在根际土 壤的分布, 从而分析豆 科植物根际的 反硝化微生 物。结果在所有样品中均检测到了 nirK 基因, 但 没有检测到 nirS 基因。采用 RFLP 和 DGGE 进一步 分析显示豆科植物根际的反硝化微生物种群随植物 的品种而显著变化 [ 25] 。英国学者从 Colne 河底沉积 物中提取 mRNA, 通过反转录 PCR ( RT - PCR) 表 达分析了 5 个反硝化基因硝酸还原酶 ( narG 和 na pA ) 、亚硝酸还原酶 ( nirS 和 nirK ) 和氧化亚氮还原 酶 ( nosZ ) , 检测 到了 nirS 和 nosZ 基因的 mRNA, 但未检测 到其它基因 [ 26] 。Henry 等 以 nirK 为目标 基因 , 开发出了用 real- time PCR 技术定量分析土 壤中反硝化细菌的方法 [ 27] , 这一方法可以线性测 定土壤环境中 10 以内 nirK 基因, 灵敏度达到 10 。 结果显 示被测土壤样品的 nirK 基因数 量在 917 @ 104 至 319 @ 106 拷贝每克土样。对 56 个 nirK 基因 序列系统学分析, 显示多数基因序列与目前已知的 可培 养 反 硝 化 微 生 物 的 nirK 基 因 序 列 不 同。 Gr ntzig 等以 Pseudomonas stutzeri 的 nirS 为目标基因 设计引物, 用 real- time PCR 技术对环境样品中的 反硝化细菌进行定量分析, 结果显示目标基因在 1 到 106 拷贝的范围内定量测定均为线性关系 ( r 2 = 01 999) , 用 此 方法 可 以准 确 测定 环 境中 的 Pseu domonas stutzeri 基因 nirS 丰度 [ 28] 。 21 4 GC- FAME、 FISH 及 16S rRNA 技术研究反硝 化微生物遗传多样性 Wang 和 Skipper 采 用脂 肪酸 甲基 酯 色谱 分析 ( GC - FAME, chromatography fatty acid methyl ester) 和 16S rDNA 序列分析鉴定了草坪根际的反硝化微 生物 [ 29] , 主要的 反硝化微 生物类群 为 Bacillus 和 Pseudomonas 。两种方法的一致性可以达到 60% 。分 别在 74% 和 15% 的反硝化微生物中检测到了亚硝 酸还原酶基因 nirK 和 nirS, 在全部反硝化微生物中 都检测到了氧化 亚氮还原酶基因 nosZ 。在非反硝 化微生物中没有检测到 nirK 和 nirS , 但检测到了 nosZ 基 因。 荧光 原 位 杂交 ( FISH, Fluorescence in situ hybridization) 技术也被用来检测活性污泥中的 反硝化微生物, 证明优势微生物为 Beta - proteobac teria [ 30] 。此外, 16S rRNA ( rDNA) 的全序列被用来 分析污水处理厂活性污泥中的细菌群体结构, 并且 被克隆到 pGEM- T 载体上进行荧光标记样品的原 位杂交, 结果 显示活性 污泥中 的优势 菌群是 B) 9 )
中国土壤与肥料 205 眼 水源井 的抽样 监测 , 地下水 硝酸盐 超标 率 231 4% , 硝酸盐超标面 积 1461 8 km , 硝酸盐已 经
2
2007( 2) N2
NO3 -
Nar
NO2 -
Nir
NO
Nor
N2 O
Nos
催化这 4 步反应的酶分别是硝酸 还原酶 ( ni trate reductase) 、 亚硝 酸还 原酶 ( nitrite reductase) 、 氧化氮 还原酶 ( nitric oxide reductase) 和氧 化亚氮 还原酶 ( nitrous oxide reductase ) , 它们相应 的编码 基因分别称为 nar 、 nir 、 nor 和 nos [ 7] 。其中亚硝酸 还原酶基因 nirK 和 nirS 催化反硝化过程中最关键 的一步反应 , 由亚硝酸盐转化为氧化氮的反应 , 是 反硝化微生物最为重要的功能基因。微生物被认为 是地球生物圈最重要的构成元素 , 在物质循环中起 着关键作用。在过去的 15~ 20 年中, 微生物生态 学发生了革命性的发展。由于微生物分子生物学的 成就, 人们不必进行微生物的分离培养和大量的性 状测定就可以快速地直接从自然界获得未培养微生 物的基因及其序列 , 并且可以根据微生物功能基因 序列分析迅速鉴定微生物、分析微生物之间的系统 学进化关系。具体到反硝化微生物及其基因资源多 样性研究领域, 分子生物学技术及由此推动的研究 新进展表现在下列几个方面 : 21 1 RFLP 技术用于研究环 境反硝化微生 物多样 性。 限制性片 段长度多态性 RFLP ( restrict ion frag ment length polymorphism) 是研究环境反硝化过程基 因多样性的有力工具。1998 年美国 Braker 实验室 通过序列比较和反复试验, 研究出了可以用来扩增 亚硝酸盐还原酶 nirK 和 nirS 基因特异性片段的引 物 , 找到了通过 PCR ( Polymerase chain reaction, 聚 合酶链式反应 ) 扩增 nirK 和 nirS 基因的方法。他 们成功地从 Blastobacter denitrif icans 、 Alcaligenes xy losoxidans 和 Alcaligenes sp1DSM 30128 扩增到了 nirK 基因, 从 Alcaligenes eutrophus DSM 530 和 IFAM 3698 扩增到了 nirS 基因。并且在沼泽地的实地使用证 明这一方法可 以定量检测沼泽环境反 硝化细菌的 nirK 和 nirS 基 因 [ 14] 。 之 后, Braker 研 究 小 组 用 RFLP 和 DNA 杂交技术分析了华盛顿海岸沉积物中 反硝化微生物 nirS 基因多样性 , 系统学分析显示 这些新 分离的 nirS 基因 聚类为 独立 的分类 单元, 不同于已 知 的可 培 养反 硝 化细 菌 的 nirS 基 因序 列[ 15] 。美国密执安大学对森林和沼泽地反硝化微 生物 nirK 和 nirS 基因进行的 RFLP 分析表明, nirS 较 nirK 更具 遗传多样性, 而且发现了 许多未曾报 道过的 nirS 基因序列 [ 16] 。Mounier 等用 RFLP 对 738 个硝酸还原酶基因 narG 克隆和 713 个氧化亚氮还