微生物分子生态学研究方法
微生物分子生态学研究进展
微 生 物 分 子 生 态 学 是 分 子 生 物 学 技 术 应 用 于 微 生 物 生 态 学 研 究 领 域 而产 生 的一 门交 叉 学 科． 它 的产 生为 微 生物 生 态学 研 究 提供 了新 的研 究方法 ． 开拓了新的领域 ． 它 在研 究 微 生 物 生 态 系统 结 构 与功 能及 其 分 子 机理 和微 生 物 与 非 生 物 环境 之 间 的相 互关 系 等方 面有 着 巨大优 势 微 生 物 分 子生 态 学 的不 断 发展 ． 推动 了微生 物 生 态 学 进入 一个 新 的发 展 时期 １ 微 生物 分 子生 态学 的发 展简 史 在 分 子 生 物 学 技 术 应 用 到微 生 物 群 落 结 构 研究 之 前 ． 人 们对 微 生 物 的研 究 主要 是 在 实 验室 条件 下 对 其进 行 培 养 、 分离、 纯 化 和特性 鉴 定 等 。 自然 界 中微 生物 实 际 生存 的环境 非 常 复杂 ． 难 以 通 过实 验 室 条件 进 行 培养 ． 而现 有 实验 室 条 件 可 以培养 的 细菌 还 不 到环 境 细菌 的 １ Ｏ ％ 因此 ． 用 传 统 培 养 方 法 来 研 究 复 杂 环 境 样 品 中微 生 物 群 落 的结 构 ． 必然 会 忽 视样 品中大 部 分微 生 物 的类 型 目前 ． 通 常用 于 分析 微 生物 群 落 结构 的方 法 基于 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增 ． 即针对 某个 基 因的保 守 区域设 计 引物 ． 对 环境 样 品 总 Ｄ Ｎ Ａ 进行 扩 增 ， 再 通过 一 定 的 手段 将 这 些 长 度 相 同 而 碱 基 组 成 不 同的 序 列 分离 开来 ． 某 种类 型 的 序列 出现 的频 率 可 以 近似 代 表 微生 物类 型 ２ 以 Ｐ ＣＲ为基 础 的研究 方法 ２ ． １ 克 隆 法 宝 来 利 来 专 栏
微生物生态学研究中的分子生物学方法
微生物生态学研究中的分子生物学方法微生物是地球上最为丰富、多样且广泛分布的生物，有着重要的生态功能。
在微生物生态学研究中，许多问题需要考虑微生物的多样性、生态学分布及其作用和适应性。
传统的微生物学研究通常依赖于纯培养和形态学特征进行分类和鉴定，但存在着很大的缺陷，许多微生物无法进行纯培养，而且在分布及功能上存在巨大的多样性和复杂性。
因此，利用分子生物学方法，在微生物生态学研究中推进更为深入的探索和解决问题尤为重要。
分子生物学方法已经成为微生物学研究中的常规手段。
其中，分子生态学作为微生物生态学研究的一个重要分支，是利用微生物群落的DNA序列来描述微生物的多样性和结构、分布模式、演化规律以及生态功能。
分子生态学是利用分子生物学技术，以微生物群落DNA为物质基础，分析微生物群落的结构及其变化和生态功能的研究领域。
常见的分子生态学方法有PCR-DGGE、PCR-SSCP、PCR-RFLP 等。
PCR-DGGE技术是一种评价微生物群落构成的分子生物学方法，也是分子生态学研究中最常采用的一种方法。
此技术通过扩增轮廓分析电泳，能够在不进行序列测定的情况下，迅速知道样品中微生物群落的构成情况。
DGGE是一种革命性的电泳技术，可以使得同样长度、不同序列的DNA分子发生不同程度的变性而达到不同的电泳迁移率，因此，能够从PCR扩增产物中分离出不同种群、不同数量的DNA序列，可用于分析种群的构成和动态变化。
PCR-SSCP技术是用来研究微生物群落中小亚基的分子生物学方法。
它可以通过分析不同峰的数量及大小，评估群落的多样性和结构。
其原理是在一定条件下，所有长度相同的PCR产物的突变体将由于核酸热变性、缺陷组态和电泳带电性质等不同而形成不同的电泳迁移率，从而显示在聚丙烯酰胺凝胶上。
PCR-RFLP技术是将PCR扩增的外显子或内含子序列用限制酶切法切开后，根据限制酶切后DNA片段的数目、大小、分布等特征，依据电泳迁移率或其他方式进行分离鉴定。
微生物分子生态学及其应用
微生物分子生态学及其应用随着科技的不断进步和生物学研究的深入，微生物分子生态学逐渐成为了一个热门的研究领域。
微生物分子生态学是指通过分析微生物的分子组成和动态变化，揭示微生物间的相互作用及其与环境的关联，探索微生物生态系统的演变和调控机制的学科。
相较于传统的微生物学研究，微生物分子生态学能够更准确、更全面地研究微生物与环境间的关联，使得微生物的研究更具针对性。
微生物分子生态学通过分析微生物的分子生物学信息，可以深入探究微生物的生理、代谢、生态等各个方面，并进一步揭示微生物的生境分布、演化和生态功能。
这不仅有助于更深入地理解微生物的生态系统，也为微生物的应用研究提供了有力的支撑。
1. 微生物分子生态学的研究方法微生物分子生态学一般通过以下方法进行研究：（1）高通量测序技术高通量测序技术大大提高了微生物分子生态学研究的效率和准确度，尤其在微生物群落结构和功能的研究中应用广泛。
基于高通量测序技术，不仅能够分析微生物群落的构成，还可以揭示微生物间的相互作用及其与环境的关联。
（2）荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术常用于微生物群落结构和空间分布的研究。
该技术通过使用荧光标记引物，能够将特定细菌、真菌或病毒等微生物直接标记并固定在试样中，观察其在不同空间中的分布情况，进而分析微生物间的相互作用。
（3）质谱分析技术质谱分析技术可以分析微生物的代谢产物，并结合高通量测序技术或荧光原位杂交技术等技术，深入探究微生物的代谢途径和功能。
2. 微生物分子生态学在环境保护中的应用微生物在环境保护中有着重要的作用，而微生物分子生态学则为环境保护提供了更加有效的手段。
（1）土壤污染修复土壤污染是一个长期而严重的问题，微生物可以分解或转化污染物，促进土壤的简易修复。
通过微生物分子生态学的研究，不仅可以深入了解微生物的生理代谢机制，还能针对特定污染物的生态功能和代谢途径，实现更加精准的修复。
（2）环境监测微生物群落是环境中的重要组成部分，通过对微生物群落的组成、分布和转化过程的研究，可以更加精准地评估环境状况。
微生物多样性的分子生态学研究
微生物多样性的分子生态学研究微生物多样性是指各种形态、类型、数量和功能各异的微生物在自然环境中存在的程度和组成，包括细菌、真菌、病毒等。
微生物是地球上存在时间最长，数量最多，功能最丰富的物种。
微生物多样性是自然生态系统的重要组成部分，对于维持自然生态平衡、促进农业、医药、环保等方面都具有重要的价值。
因此，微生物多样性的研究一直是生态学和环境科学中的重要研究方向。
分子生态学是生态学的一个分支学科，主要是利用分子生物学技术解决生态学问题的一种方法。
分子生态学的关键是将生物多样性和生态系统的结构、功能及其相互作用联系起来，通过研究DNA、RNA、蛋白质和代谢物等分子水平的细节，从而更加全面地了解生态系统的复杂性。
微生物多样性的研究需要从分子生态学的角度进行，利用现代分子生物学技术，对细菌、真菌、病毒等微生物进行分离、纯化、鉴定以及对其功能进行分析。
在微生物多样性的研究中，分子生态学扮演了重要的角色。
在过去，人们从微生物的外在形态、结构、生长特性等宏观特征入手，来进行微生物多样性的研究。
但是，由于微生物的数量巨大，形态、特征、环境适应能力高度多样，因此无法用传统的分类学方法来进行鉴定和分类。
而分子生态学的出现，则提供了新的思路和技术手段。
目前，分子生态学在微生物多样性研究中的应用主要有以下几个方面。
一、16S rRNA测序16S rRNA是所有细菌和古菌都具有的基因，与其它部位不同的是，16S rRNA序列具有相对保守和相对变异的两个区域。
利用PCR方法扩增16S rRNA序列，根据序列分析可以区分菌种、菌株、类系等信息。
16S rRNA测序是微生物分类学中一种现代的化学发展出来的技术，通过在不同生态系统中分离出的微生物，提取出它们的16S rRNA序列，利用生物信息学分析手段对其进行分类、鉴定和多样性研究。
通过16S rRNA测序，可以系统地研究微生物的多样性，探究微生物在不同环境中的分布和变化规律，探明微生物群落的组成和结构，揭示不同微生物之间的生态关系。
固碳微生物分子生态学研究
固碳微生物分子生态学研究一、本文概述随着全球气候变暖问题日益严重，碳减排和碳固定成为了全球关注的热点问题。
其中，生物固碳作为一种重要的碳减排手段，受到了广泛的关注和研究。
固碳微生物作为生物固碳的主要执行者，其在碳循环中的作用不可忽视。
本文旨在通过分子生物学和生态学的研究手段，深入探讨固碳微生物的分子生态学特性，揭示其在碳固定过程中的机理和调控机制，以期为提高固碳效率和促进生态平衡提供理论支持和实践指导。
本文首先将对固碳微生物的基本概念、分类及生态分布进行概述，阐述其在碳循环中的重要地位。
接着，重点介绍固碳微生物的分子生态学研究方法，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等，以及这些技术在固碳微生物研究中的应用和进展。
在此基础上，本文将深入探讨固碳微生物的固碳机制、环境适应性及其与宿主植物的互作关系，分析影响固碳效率的关键因素。
本文将总结固碳微生物分子生态学研究的挑战与展望，为未来的研究提供方向和建议。
通过本文的阐述，我们期望能够增进对固碳微生物分子生态学的认识和理解，为推动碳减排和生态平衡做出积极的贡献。
二、固碳微生物的多样性与分类固碳微生物的多样性是生物多样性的重要组成部分，它们在自然界中的分布广泛，从土壤、水体到大气，甚至是极端环境中都能找到它们的踪迹。
这些微生物利用各种各式的固碳途径，如卡尔文循环、还原性三羧酸循环等，将大气中的二氧化碳转化为有机物质，从而在全球碳循环中发挥着至关重要的作用。
根据固碳途径和生理特性的不同，固碳微生物可分为自养微生物和异养微生物两大类。
自养微生物能够利用无机物质（如水、二氧化碳和无机盐）进行光合作用或化能合成作用，合成自身所需的有机物质。
其中，光合自养微生物如蓝藻和绿藻，能够利用光能和无机物质进行光合作用，生成有机物质和氧气；化能自养微生物则如硫细菌、铁细菌等，它们通过氧化无机物质（如硫化物、亚铁离子等）获得能量，进而固定二氧化碳。
而异养微生物则不能自己合成所需的有机物质，它们必须从外界环境中获取有机物质作为碳源和能源。
第5讲 环境微生物分子生态
高等环境微生物学
2、茎、叶和果实上的微生物
植物的茎、叶和果实为附生微生物种群提供了良好的栖息场所， 在植物的这些部分也发现有大量的异养细菌、光合细菌、真菌(特别 是酵母)、地衣和藻类等。
高等环境微生物学
3、植物的微生物病害——植物病原体
植物的绝大多数病害都与微生物有关，也就是说很多 微生物(病毒、细菌和真菌)可引起植物疾病，不仅会产生 严重的生态问题，也会造成重大的经济损失。植物病害甚 至还会引起饥荒和人口迁移。如1845年发生在欧洲特别是 在爱尔兰的马铃薯软腐病就引起了大规模的饥荒，造成了 约1/4人口的死亡，大量的移民从爱尔兰涌入北美。
高等环境微生物学
很多研究发现，根际周围微生物的数量远远高于周围土壤 中的微生物数量，同时，根际微生物的种类受植物的种类和根 分泌物的影响, 例如，在黄瓜和玉米的根际土壤中, 荧光假单胞 菌较高, 而在大麦根际, 恶臭假单胞菌的数量较高。73%－91％ 的根的分泌物可被周围微生物用做碳源和能源。苜蓿的生长促 进根际假单胞菌的生长，而假单胞菌能够合成假单胞菌素 （pseudobactin），进一步刺激根瘤菌的生长，加强微生物－ 植物的共生固氮作用，假单胞菌不仅仅生活在根的周围土壤中， 还能侵入根的表皮以下组织 。
根瘤(Nodules)、根瘤菌及联合固氮作用
固氮菌可以与许多植物，特别是豆科植物形成根瘤结构的共生关系。 根瘤中的固氮菌从植物根系中获取其他所需营养，但其最重要的作 用是可以将大气中的氮气转化成氨，以供植物及其本身生长所需。根瘤 中根瘤菌的固氮作用对于维持土壤肥力是极为重要的。在农业生产上， 可以用于提高作物产量。根瘤形成过程是根瘤菌与植物根系一系列复杂 的相互作用的结果。
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（二）种群内部的相互作用
微生物分子生态学的研究进展
微生物分子生态学的研究进展随着科技的不断发展，微生物分子生态学这门学科开始逐渐受到关注。
微生物是地球上存在最早的生物，其在许多方面都对人类和地球生态系统的生命健康产生着巨大的影响。
研究微生物分子生态学不仅仅可以帮助我们更好地了解微生物的生态环境和活动特征，还可以探究微生物与环境因素之间的相互关系以及它们对自然界和人类生命健康的作用，对微生物和它们与其他生物的相互作用进行全面深入的研究。
1. 微生物分子生态学的研究内容及意义微生物分子生态学研究的内容涵盖了微生物群落的构成、种类、功能、相互关系、多样性等方面。
通过对微生物宏、微观层面的研究，可以探究微生物群落的空间分布规律、资源利用策略和适应机制等，进而推动微生物生态学的发展。
微生物在生态学上的重要性是不可少的，它们在环境及人体内发挥着重要的作用。
微生物能够负责环境的分解与转化，并参与生态过程例如环境营养循环、物种间拮抗与协作以及防止病原菌侵略等。
此外，在医学上，微生物是许多疾病的致病因子，如污染水源或食物的病原体、导致感染的细菌、病毒或霉菌。
因此，通过微生物分子生态学的研究，我们可以了解微生物的分布规律与生境的关系，为我们预防和治疗疾病提供基础支持。
2. 微生物分子生态学研究的方法微生物分子生态学研究方法的发展是基于分子生物学方法，包括基于核酸和蛋白质的技术和荧光原位杂交等方法的应用。
这些技术可以为微生物分子生态学研究提供大量数据，并提取出具有生态学信息的分子信息。
通过分析微生物基因组组成、微生物群落与宿主间相互作用、微生物代谢产物的分析等，可以对微生物的生态系统进行全面分析。
这些技术可以从不同方面向我们展示微生物及其环境的如实信息，从中归纳出微生物的生态特征，并从中获得与微生物生态的密切关联信息。
3. 微生物分子生态学进展微生物分子生态学的最新进展已经涵盖了许多先进技术的应用，其中最受关注的是高通量测序技术、微生物代谢组分析技术。
高通量测序技术可以对微生物基因组进行大规模的测序，并对微生物代谢反应进行一系列分析与比较，这为我们更加深入理解微生物的生态环境和活动特征提供了新的视野。
微生物生态学中的生态位理论与方法研究
微生物生态学中的生态位理论与方法研究微生物是地球上最古老、最广泛分布、数量最多、鉴定最困难的生物类群之一，是支持生态系统运作的基础。
微生物生态学研究微生物在不同生态环境中的数量、分布、功能以及它们之间的相互作用。
生态位理论是微生物生态学中重要的理论基础，对生物的适应性、竞争关系和生态位资源利用具有重要的指导意义。
本文将介绍微生物生态学中的生态位理论以及实验方法的研究进展。
生态位理论生态位是指生物与周围环境中的因素相互作用的空间在物理（生境）和功能（作用）两个方面的总和，是描述物种在生态系统中的占据位置及其与周围物种的关系的一种生态概念。
其基本观点是：生态位可以被人们看成“生态位置”，也可以被看做“生态空间”；任何一种生物对于生存条件的要求都表现在其生态位上。
根据生态位的定义，可以得知生态位有其内部和外部两个方面。
内部生态位主要包括营养特性、生长条件要求等方面，而外部生态位则是由生境的特点如温度、湿度、PH等环境因素所决定。
生态位理论不仅适用于微生物，也可以适用于动植物等多种生物学研究中。
生态位可分为空间生态位和时间生态位。
空间生态位是指一个物种在空间上的所占据的位置，而时间生态位是指一个物种在时间上所占据的位置。
一个物种的时间生态位也可以看做是对多个空间生态位的运用。
生态位的占据程度是一个相对的概念，不同物种占据的生态位是不一样的。
对于同一生态位的不同物种，按照它们在竞争、合作方面所表现出的适应性，来分配它们的占有度，这个分配程度叫做相对占有度。
生态位因此成为微生物生态学研究的核心之一。
生态位理论的应用微生物生态学研究中常常借助生态位理论进行相应的研究。
一个物种在特定的环境条件下所占据的生态位影响着其在生态系统中的角色、数量以及影响力等等。
生态位的作用也可以归纳为以下几个层面。
1. 确定菌群定殖在特定环境条件下，生境能够容纳或支持的微生物种类种类是有限的，具体哪些微生物可以占据生态位分别取决于其相对适应性和浓度势能。
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• 显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链 温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。 • MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个 解链区域。
• 不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区 域及各解链区域的解链温度也是不一样的。
微生物分子生态学的一些研究方法
微生物群落结构和多样性是微生物生态学 研究的热点内容。
群落结构决定了生态功能的特性和强弱。 群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。 群落结构变化是标记环境变化的重要方面。
通过对环境微生物群落结构和多样性进行解析并研究 其动态变化，可以为调节群落功能和发现新的重要微 生物功能类群提供可靠的依据。
2、群落水平生理学指纹方法(CLPP)
微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。 如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质， 则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一。 由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理学指纹方法 (CLPP)，通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的 酶活性的分析方法。 具体而言，CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳 源的利用能力，来确定哪些基质可以作为能源，从而产生对基质 利用的生理代谢指纹。
Diversity estimation based on molecular markers
实验原理
• 16S rDNA是基因组的“biomarker‖ • – 核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16S rDNA 广泛存在于所有原核生物的基因组中。 • – 16S rDNA的序列中包括保守区和可变区。 • – 序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应， 而且一般不发生水平转移。 • – GeneBank和RDPⅡ（Ribosomal DatabaseProject ） 数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释 的16S rDNA序列，可供进行比对。
4. ERIC (肠杆菌基因间保守重复序列) -PCR 指纹图谱技术
• Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合 菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规 RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。
• 在微生物群落中，各细菌数量占1-10%时，其特征性 ERIC-PCR主条带就可以在指纹图中表现出来。ERICPCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生 物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的 多少，条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低。
BIOLOG鉴定系统
在96孔细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源（95种） 利用情况。 干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑 微生物利用碳源进行呼吸时（产生的NADH），会将四唑从无 色还原成紫色。 每个孔中含有 不同的底物 菌悬液或 无菌水
自动化、快速
可鉴定细菌有1140多 种、酵母菌267种、目前 已经可用于丝状真菌。
பைடு நூலகம்
• 分析不同环境样品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指 纹图谱的差异，就可比较不同生态系统微生物群落的 差异，或者同一个群落在不同功能状态下的结构变化。
ERIC-PCR引物20 pmol/μl
E1: 5'-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3' E2: 5'-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3'
• ―TA的过程： • 1.Amp抗性，挑选出含有质粒 的克隆 • 2.蓝白斑筛选，挑出带有插入 片段的克隆 • 3.PCR筛选，挑出带有正确长 度插入片段的克隆
ARDRA分型与测序
各OTU含有的克隆数量克隆的统计分析5. 以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法
• 用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列包 括：核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基 因的序列、重复序列和随机基因组序列等。
• 最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。 rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序 列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要 指标。
醌指纹法(Quinones Profiling) 呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链 中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q) 和甲基 萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊 二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一 步区分。
每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的 微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多 样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹） 的变化可表征群落结构的变化。
• 当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和 在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
• 一旦DNA 片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA 片 段最低的解链区域解链，部分解链的DNA 片段在胶中的迁移 速率会急剧降低。因此，不同的DNA 片段会在胶中的不同位 置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分 开来。
仅能鉴定快速生长的微生物，误差较大（pH），拥有的标准数据 库还不完善
3、生物标记物法（Biomakers ）
• 生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其 总量通常与相应生物量呈正相关。 • 特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记 物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹 估价微生物群落结构。 • 首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环 境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适 的仪器加以定量测定。 优点：不需要把微生物的细胞从环境样中分离， 能克服由于培养而导致的微生物种群变化，具有 一定的客观性。
• 这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠 道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环 境当中前所未知的微生物的行16S rDNA PCR扩增：把环境中几 乎所有微生物基因组上的16S rDNA扩增并收集到一起。 • universal primers: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5’-TACCTTGTTACGACTT3’ (E.coli bases 1507 to 1492)
Source: Louis, B., Gene IV年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海 海面上浮 • 发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群； • 与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生 物多样性；
微生物群落结构和多样性研究方法：
• 20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态 学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和 计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平 低。 • 在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一 些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法），对 环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的 层次上。 在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物， 通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较 精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了 关于群落结构的直观信息。
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)
community DNA f-primer PCR r-primer CUT A B C PAGE on SEQUENCER
Relative Intensity
C B A
16S rDNA
Fragment Size (base pairs)
A B C (ABC) internal siz e fragment
Liu et al., 1997, AEM
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。 • Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落 结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝 胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis， TGGE）。 • 此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学 研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群 落结构的主要分子生物学方法之一 。
醌指纹法具有简单快速的特点。
磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪 酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析
• 磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在 细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢 掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动 态监测。 • 脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生 物分类的依据。 • 磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然 后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。 • 甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析 出全细胞的FAME谱图。 • 脂肪酸谱图法分类水平较低，不能鉴定到种。另外，不同微 生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂 肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。
16S ribosomal RNA
Present in all life • molecular chronometer – taxonomy (large database) – evolution one active bacterial cell: – ~ 104 copies – ~ 15 rRNA genes (i.e., rDNA) (Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Sulfolobus solfataricus with 1 copy, Clostridium paradoxum with 15 copies) ~1500 nt (enough information) – four different domains – conserved regions (no variation among all life) – variable regions (V1-V9)