[精选]动物细胞培养和核移植技术--资料

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动物细胞培养和核移植技术

◆体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体◆胚细胎胞移供体动物进行了100植%的至复代制孕
吗？为什么？受体内
妊娠、分娩 ◆遗传物质基本相同
体细体胞细核胞移核植移的植原的理过：程动
物细胞核具有全能性受精
供体细胞（供核）
细胞
体细胞
卵
培养
注入
细胞重组
卵巢卵母细胞（MⅡ中期：
供质）
去
去核卵融合细胞
2.原理：动物细胞核具有全能性
胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易
动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难
3.分类：胚胎细胞核移植、体细胞核移植
4.体细胞核移植的过程
供体：优质高产奶牛
◆为何取供体细胞传代培养10代
以内的细胞？
10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未
发生突变。
治疗人类疾病，作为组织器官移植的供体
主要的优点是？
不发生免疫排斥反应
◆研究克隆动物和克隆细胞更了解胚胎发育及细胞衰老过程；克隆动物做疾病模型，更好追踪研究疾病
的发展过程和治疗疾病。
6.体细胞核移植技术存在的问题
（1）成功率仍然非常低，产下的活克隆动物比率平均不到10%。
（2）绝大多数克隆动物还存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发
因为在这个时候去核的话对卵细胞损伤最小，距离很近，
便于去核。
◆为什么不是取供体细胞核进行核移植操作，而是直接将供体细胞整个注入去核卵
母细胞中？
保证供核不被破坏，使所得个体的性状
更符合供体。
◆激活方法：
◆激活目的：
◆促融方法：电刺激

动物细胞培养和核移植技术(第1课时)

动物克隆
利用核移植技术可以生产出克隆动物，为科学研究、动物育种和濒危动物保护等领域提供支持。
转基因动物
利用核移植技术可以生产出转基因动物，用于药物研发、生物反应器生产和人类疾病模型等方面。
人类疾病研究
通过核移植技术可以生产出人类疾病模型动物，为研究人类疾病的发生、发展和治疗提供有力支持。
基因编辑
利用核移植技术结合基因编辑技术，可以对动物基因进行精确的编辑和改造，为基因治疗和遗传疾病研究等领域提供新的手段。
细胞分离与传代
血球计数板法
流式细胞仪法
MTT法
Trypan blue染色法
细胞计数与活力检测
利用血球计数板对细胞进行计数，通过显微镜观察计数板上的细胞数目。
利用流式细胞仪对细胞进行计数和活力检测，可以快速准确地检测大量细胞。
通过检测细胞代谢产物来评估细胞活力，常用的试剂是MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）。
核移植技术的展望
02
应用于再生医学和疾病治疗
核移植技术有望在再生医学和疾病治疗领域发挥重要作用。例如，通过将患者的细胞核移植到去核的卵母细胞中，可以生成具有患者特异性的人工胚胎干细胞，用于治疗各种遗传性疾病和罕见病。此外，核移植技术还可以用于生产转基因动物、制备细胞疗法等。
03
加强伦理和法规监管
随着核移植技术的不断发展和应用，伦理和法规监管也需要不断加强和完善。这可能涉及到制定更加严格的法律法规和技术标准，以确保技术的合理和合法应用，并保护人类的生命健康和伦理道德。
动物细胞培养的定义
动物细胞培养技术广泛应用于生物学、医学、农业和工业等领域，用于研究细胞生物学、药物筛选、疫苗研制等方面。

动物细胞培养和核移植技术-刁金山

3.温度和：36.5+0.5度；PH为7.2-7.4 温度和pH：36.5+0.5度 PH为7.2温度和 4.气体环境：气体环境：气体环境
培养皿或松盖培养瓶，置于空气和5% CO2 ）培养皿或松盖培养瓶，置于O2和CO2（95%空气和空气和
学案p2相关问题学案相关问题
1.3 动物细胞培养技术的应用
6、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，胰蛋白酶能将细胞消化掉组织分散成单个细胞要注意什么问题呢注意什么问题呢？组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？注意时间的控制 7、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？不能，因为两者的最适PH不同，不能，因为两者的最适PH不同，而正常组织 PH不同细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH PH较接近细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近
（三）、过程：）、过程：过程
1
2
3
4
（三）、体细胞的核移植过程）、体细胞的核移植过程
高产奶牛A 高产奶牛供体细胞培养供体细胞
？
卵母细胞培养去核卵母细胞供卵奶牛B 供卵奶牛
？
无性生殖
电刺激使两细胞融合重组细胞
激活重组胚胎
？
胚胎移植
代孕母牛C 代孕母牛新个体
为什么用去核卵母细胞作为体细胞核的受体？为什么用去核卵母细胞作为体细胞核的受体？
通过核移植方法得到的动物叫克隆动物。通过核移植方法得到的动物叫克隆动物。克隆动物
（二）、分类：）、分类：分类
胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度低，细胞分化程度高，体细胞核移植：体细胞核移植细胞分化程度高，恢复全能性困难

动物细胞工程动物细胞培养和核移植技术

核移植操作
显微操作
在显微镜下，将供体细胞核移植到受体细胞中。
融合与激活
通过电刺激或化学方法诱导受体细胞与供体细胞融合，并激活新形成的细胞。
筛选与鉴定
对新形成的细胞进行筛选和鉴定，确保核移植成功。
重组胚胎的培养与移植
胚胎培养在适宜的培养条件下，对重组胚胎进行培养，促进其发育。
胚胎移植将培养成熟的胚胎移植到代孕动物体内，以产生后代。
融合后的细胞开始分裂和发育，最终形成与供体具有相同遗传物质的克隆个体。
核移植技术流程
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供体细胞的选择与准备
选择适当的供体细胞
01
根据实验需求选择具有所需特性的供体细胞，如特定组织或器
官来源的细胞。
细胞培养准备
02
确保供体细胞处于适宜的培养环境中，包括适当的培养基、温
度、气体条件等。
细胞传代与扩增
03
对供体细胞进行传代和扩增，以获得足够的细胞数量用于核移
植。
受体细胞的选择与准备
选择适当的受体细胞
根据实验需求选择具有良好接受性的受体细胞，如去核的卵母细胞。
去核处理
使用显微操作技术去除受体细胞的细胞核，为核移植做好准备。
受体细胞激活
通过化学或电刺激方法激活受体细胞，使其恢复分裂活性。
细胞分离
通过离心、过滤等方法将细胞从酶液
3
中分离出来。
培养环境控制
提供适宜的温度、湿度、气体环境，
5
保持培养基的营养成分和pH值。
组织消化
2
使用适当的酶液将组织分解成单个细
胞。
细胞接种
4
将分离出的细胞接种到培养容器中。
传代细胞培养

动物细胞培养和核移植技术-课件

■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。
强调三：接触抑制
■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时, 细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
P46讨论
多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：
3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？
绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。
此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。
该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。
（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。
2.2 动物细胞工程
动物细胞工程常用的技术

2.2.1动物细胞培养和核移植技术

接触抑制传代培养
原代培养 (primary culture)
• 定义：把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。 •过程：从动物机体中取出组织剪碎加胰蛋白酶细胞游离加培养液将细胞接种到培养瓶内培养（1—2天换一次培养液）细胞贴壁生长长成单层细胞
先用剪刀剪碎,后用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。
动物细胞培养过程 3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？细胞间的物质主要是蛋白质（胶原纤维）。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6 时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜 pH为7.2～7.4。
一.动物细胞培养
(一)概念
从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
(二)、动物细胞培养过程阅读“动物细胞培养过程”并思考： 1、动物细胞培养的技术实施的原理是什么？特点是什么？ 2、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？ 3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？ 4、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？ 5、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？ 6、简述动物细胞培养的操作过程。
原代培养与传代培养的区别
原代培养：
分装之前，10代以前பைடு நூலகம்
传代培养：
分装后继续培养，10代以后
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。

动物细胞培养和核移植-Ela

06
动物细胞培养和核移植技术挑战与展望
技术挑战及解决方案
细胞培养条件优化
动物细胞对培养环境敏感，需精确控制温度、pH值、
营养因子等。
核移植效率提升
当前核移植成功率低，影响技术应用。
异种核移植兼容性
不同物种间细胞核与细胞质的兼容性差异大。
解决方案
开发智能化培养系统，实时监测并调整环境参数。
核移植操作
将筛选出的供体细胞核注入到准备好的受体细胞中，形成重构胚。
重构胚的培养
为重构胚提供适宜的培养条件，如培养基成分、温度、pH值等，以促进其正常发育。
观察与检测
定期对重构胚进行观察，检查其发育情况、形态变化等，并通过相关技术手段检测其遗传物质和表型特征。
05
实验设计与数据分析
实验设计思路及方案
受体细胞培养与准备
选择合适的受体细胞
通常选择去核的卵母细胞作为受体细胞，这些细胞具有重编程供体细胞核的潜力。
受体细胞的准备
对受体细胞进行去核处理，去除其原有的遗传物质，为供体细胞核的植入提供空间。
受体细胞的培养
在核移植前，需要对受体细胞进行短期的培养，以确保其处于良好的生理状态。
核移植后细胞培养及观察
研究目的
01
建立高效的动物细胞培养体系
通过优化培养基成分、培养条件等，建立适用于不同种类动物细胞的高
效培养体系，提高细胞生长速度和增殖能力。
02
探究核移植技术对细胞培养的影响
通过核移植技术，研究不同供体细胞核在受体细胞中的重编程和发育潜
力，以及核移植对细胞生长、分化等生物学特性的影响。
03
开发新的生物制品生产方法
实验目的

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植物组织培养动物细胞培养
原理
细胞的全能性
细胞增殖
培养基性质
固体培养基
液体培养基
培养基特有成分蔗糖、植物激素
葡萄糖、血清、血浆
培养结果
植物体
细胞株、细胞系
培养目的
快速繁殖、培育获得细胞或
无病毒植株等
细胞产物
应用：
大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）
作为基因工程中的受体细胞培养的动物细胞可以用于检测有毒物
2.2 动物细胞工程
提问：
植物细胞工程常用的技术手段有哪些？
植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术
动物细胞工程常用的技术手段：
动物细胞培养技术、动物细胞核移植技术、动物细胞融合技术、生产单克隆抗体技术
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
2.2.1 动物细胞培养和核移植技术
一、动物细胞培养
概念:就是从动物机体中取出相关的组织, 将它分散成单个细胞，然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。
植物组织培养在无菌和人工控制的条件下,将离体的植
物器官、组织、细胞，培养在人工控制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
一、动细胞培养
选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、
原代培养
稀分释装
传代培养
培养过程：
动物胚胎或幼龄动
培养过程：
物的组织、器官
胰蛋白酶
动物组织细胞间隙中
（分解弹性纤维）
含有一定量的弹性纤单个细胞
维等蛋白质，将细胞
加培养液
网络起来形成具有一细胞悬浮液
定弹性和韧性的组织
原代培养
和器官。
10代细胞
遗传物质未改变
细胞株
动物细遗已胞传改培物变养质不细能胞系最终培养成生物体
思考题
14、如何理解原代培养和传代培养？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养
15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？不都能
16、有些为何能一直传下去？发生突变，朝着癌细胞方向发展
17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？
不全是
思考题
18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存10代以内的细胞，因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展
50代细胞无限传代
传代培养
思考题
1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？没有２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？是
３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？成块的组织细胞靠在一起,彼此
限制了细胞的生长和增殖４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？
先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理。
质，判断某种物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理
论依据
二、动物体细胞核移植技术和克隆动物
概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。
思考题
５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？
胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质６、细胞膜的主要成份是什么？蛋白质和磷脂７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能
８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？
注意时间的控制
思考题
９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
不能，因为两者的最适pH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适 pH较接近１０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？
胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛
思考题
11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖
12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。 13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养
动物体细胞大都生活在液体的环境
与植物培养基相比（1）液体培养基
其特点是：
（2）含有血清、血浆
培养条件：
1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、
微量元素、维生素、血清、血浆等。合成培养基）
3、温度和pH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4
器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。分散成单个细胞在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶
或胶原蛋白酶分散细胞，说明细胞间的
物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的pH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4) 的活性较高。
一、动物细胞培养
19、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体
讨论
多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下问题：
1.体外培养细胞时需要提供哪些物质充足的营养供给、适宜的温度、适宜的 pH和气体环境
2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？无菌、无毒的环境。
培养条件：
1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、
微量元素、维生素、血清、血浆等。合成培养基）
保证细胞顺利的生长增殖
培养条件：
动物细胞培养液的主要成分：
葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、血清、血浆等。
4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）
思考题
动物细胞培养液的主要成分是什么？
较植物组培培养基有何独特之处？主要成分：
葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、血清、血浆等。
独特之处有： 1、液体培养基 2、成分中有血清、血浆等
植物细胞和动物细胞培养的比较
比较项目
动物细胞生长特性：
细胞贴壁：
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
细胞的接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
动物机体组织
胶原蛋白
酶胰蛋白
酶
单个细胞
原代培养