RNA干扰 (RNA interference ,RNAi)
RNA干涉
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是1998年由Fire等在线虫中发现的一种转录后的基因沉默(Posttranscriptional gene silencing，PTGS)机制。
双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)能特异地抑制或沉默目的基因表达，产生如同目的基因突变的缺陷表型，这种由dsRNA介导的基因阻抑作用被称为RNAi。
1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组，在矮牵牛中发现的一种转基因能同时抑制相应的内源基因以及自身表达的基因沉默现象，当时将这种现象称为共抑制。
到1994 年，由Cogni等在真菌中发现转录后的基因沉默现象，在野生型粗糙链胞霉中转入胡萝卜素基因albino 1或albino 3时，发现在部分实验中，内源性al 1或al 3基因的表达水平反而减弱，称此现象为基因压制(quelling)。
1998年，Fire等在线虫中发现了RNAi现象，并揭示了SuGuo发现正义RNA对基因表达也有抑制作用的原因，认为SuGuo发现的这种现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量的双链RNA，而且dsRNA 能比反义RNA或正义RNA更有效地抑制基因的表达，把由RNA引起的基因表达的抑制称为RNA干涉。
最初普遍认为共抑制、基因压制以及RNAi是机制完全不同的基因抑制现象。
但经过科研人员的不断研究，发现在共抑制、真菌中的基因压制以及RNAi现象之间存在着密切的联系。
都是由RNA引起的转录后的基因沉默，可能有共同的生物学意义和相似的作用机制。
但是共抑制与RNAi并不是完全相同，在植物的共抑制中，dsRNA不仅能引起转录后的基因沉默，而且还能引起转录水平的沉默，其可能机制是dsRNA能引起染色质的重组或甲基化而改变其内源基因的序列。
因此，在植物共抑制中还存在RNAi以外的由RNA指导的DNA 甲基化，而引起转录水平抑制的机制。
dsRNA能特异地抑制目的基因的表达，其广泛存在各种有机体中，包括线虫、果蝇、涡虫、水螅、锥虫、真菌、植物以及哺乳动物。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。
RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。
它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。
RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。
1 RNAi的历史背景20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。
而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。
当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。
1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。
而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。
他们将这一现象称为RNAi。
因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。
此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。
rna干扰
RNA干扰什么是RNA干扰？RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过特定的RNA分子干扰基因表达的现象。
这种现象最早被发现于植物和线虫中，后来发现在动物中也普遍存在。
RNA干扰通过介导mRNA的降解或抑制转录来实现靶向基因的沉默。
RNA干扰的机制主要是通过一种特殊的小RNA分子，称为干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或小干扰RNA （short interfering RNA，shRNA）。
这些siRNA或shRNA是由外源性或内源性的长双链RNA在细胞内被核酶Dicer切割而成的20-30个碱基的双链RNA分子。
RNA干扰的过程RNA干扰的过程可以分为三个主要步骤：siRNA的产生、siRNA的引物和RNA诱导沉默复合物（RISC）的形成、RISC 介导的mRNA降解或转录抑制。
首先，外源性或内源性的长双链RNA被核酶Dicer切割成20-30个碱基的siRNA。
siRNA由RNA诱导沉默复合物（RISC）捕获，其中的一个链被释放，留下一个导引链和一个剪切链在RISC中。
接下来，导引链将与靶标mRNA互补结合。
RISC将靶标mRNA切割成小片段，导致mRNA的降解或转录抑制。
这种RNA干扰过程可以非常特异地沉默特定的基因表达。
RNA干扰在基因研究中的应用RNA干扰已经成为基础科学研究和功能基因组学研究中广泛应用的工具。
通过沉默特定基因的表达，研究人员可以揭示该基因在生物学过程中的功能，以及该基因对疾病发展的影响。
在细胞水平上，RNA干扰可以用于验证候选基因是否在特定生物途径中起关键作用，或者用于筛选新药物靶点。
研究人员可以通过转染siRNA或shRNA来干扰目标基因，评估其对细胞功能的影响。
在动物模型中，RNA干扰可以用于研究特定基因的作用。
通过通过siRNA或shRNA直接注射进入动物体内，可以沉默目标基因的表达，并观察动物表型的变化。
RNA干扰与siRNA研究进展
RNA干扰与siRNA研究进展一、本文概述RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种广泛存在于生物体内的基因沉默现象，其通过双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱导同源mRNA的降解，从而实现对特定基因表达的调控。
自1998年Fire和Mello首次在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现这一现象以来，RNAi已成为生物学领域研究的热点之一。
siRNA （small interfering RNA）是RNAi过程中的关键分子，其通过与mRNA的特异性结合，引导RNA诱导的沉默复合物（RISC）对mRNA进行切割，从而实现基因沉默。
近年来，随着研究的深入，人们对RNAi 和siRNA的作用机制、生物学功能以及应用前景有了更深入的了解。
本文旨在综述RNA干扰与siRNA研究的最新进展，探讨其在基因功能研究、疾病治疗以及农业生物技术等领域的应用前景。
二、RNA干扰机制RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种在生物体内广泛存在的基因表达调控机制，主要通过双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发，导致同源mRNA的降解或翻译抑制，从而实现基因沉默。
RNAi机制的核心是siRNA（small interfering RNA）的生成和作用。
siRNA的生成起始于dsRNA的形成。
这些dsRNA可以是由外源基因导入的，也可以是细胞内自身产生的。
当dsRNA进入细胞后，会被一种名为Dicer的核酸酶识别并切割成21-23个核苷酸长度的siRNA。
Dicer酶在切割过程中，会在siRNA的3'端添加2个核苷酸（通常是尿嘧啶），形成siRNA的双链结构。
随后，siRNA会与一种名为RISC（RNA-induced silencing complex）的蛋白复合物结合，形成RISC-siRNA复合物。
RNA干扰技术基本原理和应用
RNAi旳主要过程
效应阶段 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 旳形成 RISC旳激活：ATP依赖旳解双链过程 在siRNA反义链旳指导下(靶序列旳辨认）， RISC特异性切 割、降解靶mRNA，造成基 因体现失活
NS3-1948 siRNA +
HCV体现质粒
共转染
Huh-7 细胞
HCV RNA ↓ 23倍
GAPDH siRNA
+
HCV RNA 无变化
谢 谢!
2023 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性旳
阻断效应，并发觉体内分解dsRNA 为 siRNAs (short/small interfering RNA) 旳 DICER 酶
RNAi旳发觉和发展历程
2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒旳阻抑
Dicer酶
RNAase III超家族组员。构造中涉及一种 螺旋酶构造域，两个RNA酶Ⅲ构造域，一 种双链RNA结合位点 对单链RNA没有活性 对200~500nt旳dsRNA作用效果最佳，能 降解成25nt左右旳siRNA 广泛存在
RdRp（RNA dependent RNA polymerase）
siRNA旳制备措施
细胞内制备措施 依赖体现质粒或病毒载体在细胞内获取 siRNA 经过PCR介导旳siRNA体现试剂盒获取 siRNA
siRNA载体
依赖RNA聚合酶III 开启子(pol III) ，操纵一 段小旳发夹siRNA在哺乳动物细胞中旳体 现。
试述rna干扰的原理和应用.
试述RNA干扰的原理和应用原理介绍RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种基因沉默的现象，通过转录后基因沉默的方式调控基因表达。
它在生物体内通过小分子RNA（siRNA和miRNA）介导的机制实现，可以靶向特定基因的mRNA并导致其降解或抑制转录，从而抑制目标基因的表达。
RNA干扰的主要原理是，由于siRNA或miRNA的序列与目标mRNA的序列互补配对，形成二重链结构，通过RNA诱导的沉默复合物（RISC）的介导，将目标mRNA特异性地降解。
RNA干扰可以发生在真核生物和原核生物的细胞内，包括植物、动物和微生物。
RNA干扰的应用RNA干扰在基因研究和生命科学领域有着广泛的应用。
下面以几个具体的应用为例进行介绍：1. 基因功能分析RNA干扰技术可以通过特异性地沉默特定基因的表达，来研究目标基因在细胞、组织或整个生物体中的功能。
通过沉默目标基因后的观察，可以推断该基因对特定生理过程或病理过程的影响，并进一步揭示基因功能的机制。
2. 新药研发RNA干扰技术可以用于筛选化合物或药物的靶点，从而加速新药的研发过程。
通过靶向关键基因的RNA干扰，可以模拟药物对这些基因的影响，从而评估化合物或药物的疗效和毒副作用。
这种方法可以减少药物研发的耗时和成本，提高药物筛选的效率。
3. 疾病治疗RNA干扰技术在疾病治疗方面有着巨大的潜力。
例如，通过沉默特定基因，可以抑制癌细胞的生长和扩散，从而实现肿瘤的治疗。
此外，RNA干扰还可以用于治疗病毒感染、传染性疾病和遗传性疾病等方面的研究和治疗。
4. 遗传改良RNA干扰可以通过抑制特定基因的表达，来改良农作物的性状和品质。
通过设计特异性的siRNA或miRNA，可以有效地抑制农作物中不良性状的表达，提高农作物的产量、抗病性和抗逆性。
RNA干扰的前景和挑战RNA干扰技术的广泛应用在生命科学和医学领域展现出巨大的潜力，但同时也面临着一些挑战。
其中主要的挑战包括：1.递送技术：RNA干扰技术需要将siRNA或miRNA送达到目标细胞或组织内，而递送技术仍然是一个难题。
RNAi技术
RNAi技术1. 引言RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）技术是一种基因沉默技术，通过利用小分子RNA分子调节基因的表达，从而实现对目标基因沉默的目的。
RNAi技术的出现，彻底改变了分子生物学的研究方法，为研究基因功能以及治疗基因疾病提供了新的手段和途径。
2. RNAi技术的原理RNAi技术基于RNA干扰生物过程中产生的一种自我保护机制，即小分子RNA分子干扰RNA的翻译过程。
在这个过程中，RNAi分子通过与RNA互补配对，形成RNA-RNA复合物，这种复合物在RNA酶的作用下被剪切成更小的RNA分子。
这些小RNA分子可以继续识别新的RNA，并在细胞中导致基因沉默（图1）。
图1 RNAi技术的原理示意图3. RNAi技术的应用3.1 RNAi技术在基因功能研究中的应用RNAi技术被广泛应用于分子生物学和细胞生物学的研究中。
通过设计和构建与目标RNA互补的RNAi分子，可以实现对该基因的瞬时或持续沉默。
这种方法可以用来研究基因在生物学过程中的功能以及相互作用，同时也可以用来筛选或验证药物靶标。
3.2 RNAi技术在疾病治疗中的应用由于RNAi技术可以实现对单一基因的沉默，因此它成为治疗基因疾病的一种有效手段。
通过将RNAi分子直接引入到体内，可以实现对特定疾病相关基因的沉默，从而治疗疾病（图2）。
图2 RNAi技术在疾病治疗中的应用示意图4. RNAi技术的优缺点4.1 优点（1）靶向性好：RNAi技术可以实现对特定基因的沉默，从而精确地调控基因表达。
（2）效率高：RNAi技术可以快速地实现基因沉默，因此在基因研究和药物研发中得到了广泛应用。
（3）安全性高：RNAi技术只对特定基因的表达产生影响，不会对细胞或机体整体产生不利影响。
4.2 缺点（1）技术复杂：RNAi技术需要专业知识和技术，因此需要专业技术人员操作。
（2）RNAi分子稳定性低：RNAi分子容易被降解，因此在RNAi技术的应用中需要结合载体和转染技术来增加RNAi分子的稳定性和转染效率。
rnai分子机制
RNAi（RNA interference），也称RNA干扰，是一种通过RNA分子阻止基因表达的现象。
RNAi在生物科技研究、药物研发等领域得到广泛应用。
RNAi的分子机制主要涉及到三种方式：
1. 小干扰RNA机制：外源性（如病毒携带）的dsRNA在体内被Dicer酶加工成21-23nt长度的siRNA，按照碱基互补配对原则与靶mRNA完全互补配对而引发靶mRNA的降解，从而抑制靶基因的表达。
2. 重复相关siRNA机制：来源于基因组内重复序列的dsRNA在体内被Dicer 酶加工成siRNA分子，形成RNA诱导的转录沉默复合体，进一步识别DNA序列上的互补序列，引起染色质修饰。
3. 微小RNA（miRNA）机制：与siRNA不同，miRNA与靶mRNA的结合是通过碱基的不完全互补配对而实现，它并不引起靶mRNA的降解而是引起靶mRNA在翻译水平上的抑制。
RNAi的作用是在多重水平上发挥作用的。
最初在华丽新小杆线虫中发现，dsRNA所诱导的基因沉默在转录后水平，因为dsRNA导致了相应RNA（mRNA）的降解，而基因启动子和内含子序列作为基因沉默触发物则无效。
后来在植物中也发现，RNAi引起的基因沉默也是在转录后水平。
除此转录后水平降解mRNA 的机制外，RNAi还通过其他机制来影响基因表达。
总的来说，RNAi的分子机制涉及到多种复杂的生物学过程和分子互作，这些过程共同实现了对基因表达的精确调控。
1。
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二、RNAi作用机制
当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切 酶（ Dicer ）识别，切割成 21-23 核苷酸长的小片 段，这些片段可与该核酸酶的 dsRNA 结合结构域结 合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后， mRNA 与 dsRNA 的有义链发生链互换，原 先 dsRNA 中的有义链被 mRNA 代替，从酶 -dsRNA 复合 物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对 mRNA进行切割，这样又产生了 21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合 物，继续对目的 mRNA进行切割，从而使目的基因沉 默，产生RNAi现象。
三、RNAi研究的一般技术路线
1、siRNA 的设计
何为siRNAs
siRNA
（ small interfering RNAs ， siRNAs ） 即为能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标并 将其降解而介导 RNA 干扰途径的短片断双链 RNA分子。
一般设计原则
（ 1 ）从 mRNA 的 AUG 起始密码开始，寻找“ AA” 二连 序列，并记下其 3' 端的 19 个碱基序列，作为潜在 的 siRNA 靶位点。有研究结果显示 GC 含量在 30%— 50% 左右的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更为有效。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或 者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他 编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因 需要设计 4-5 个靶序列的 siRNA ，以找到最有效的 siRNA序列。
RNAi 的基本过程：
siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能 量；
RISC（RNA-induced silencing complex）形成：
与RNAi辅助蛋白结合形成RISC，消耗ATP能量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合 体转变成活性形式； 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC 识别并切割互补的靶RNA，无需或消耗少量ATP。
负对照
一个完整的siRNA实验应该有负对照。 作为负对照的 siRNA 应该和选中的 siRNA 序列
ห้องสมุดไป่ตู้
有相同的组成，但是和 mRNA 没有明显的同源 性。 通常的做法是将选中的 siRNA序列打乱，同样 要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。
2、制备siRNAs的方法
1.化学合成； 2.体外转录； 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA； 4. siRNA表达载体 5. siRNA表达框架
分子生物学实验技术
RNA干扰
（RNA interference ，RNAi）
重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室 刘先俊
实验目的
1.掌握RNA干扰的基本原理；
2.了解研究RNA干扰的技术路线及应用。
一、RNAi概述
RNAi：短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA 特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基因沉 默（gene silence)的现象。因此，又称为 knockdown。
制备siRNA5种不同方法的比较
制备siRNA5种不同方法的比较（续）
4. 转染细胞 5. RNAi的效果分析
RNAi 的应用
基因功能分析 胚胎发育与干细胞基因调控研究 细胞增殖与分化基因调控研究 细胞生长与转移基因调控 多基因疾病发病机制研究 表观遗传学分析（RNAi可诱导基因甲基化） 信号通路新分子的筛选与鉴定 寻找新的药物靶标、基因治疗 药物作用机制探讨