RNA干扰综述
第七组分子报告《RNA干扰》总结
第七组分子报告《RNA干扰》总结组长：方刚组员：张科强范宇巧田甜肖鹏车斌我们组报告的主题是“RNA干扰”。
首先，何谓“RNA干扰”呢？如果将RNA干扰看作一种生物学现象，可以有以下定义：①RNA干扰是由dsRNA介导的有特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。
②RNA干扰是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象，是一种具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒的RNA同源的基因一起沉默的现象。
如果将其作为一门生物技术，则可定义为：①RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 从而特异性地抑制靶基因,通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(正义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,阻止基因表达的技术。
②RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，达到相应的基因沉默的技术。
③RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA导入细胞,特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 为转录后水平的基因沉默技术(post - transcriptional gene silence , PTGS)。
其次，RNA干扰的基本过程和机制如下：第一步（起始阶段）：是较长ds RNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）（见图一）。
图一第二步（效应阶段）：是siRNA 在ATP 参与下被RNA 解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex ，RISC)（见图二）。
关于RNA干扰的综述
关于RNA 干扰的综述一、相关概念基因沉默：通过人工手段使基因的最终产物无法表达。
分为转录前水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默（TGS和PTGS ）。
TGS 是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默，例如转基因植物体内特定基因的甲基化，导致无法转录。
PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。
反义RNA ：反义RNA 是指与mRNA 互补的RNA 分子，也包括与其它RNA 互补的RNA 分子。
由于核糖体不能翻译双链的RNA ，所以反义RNA 与mRNA 特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA 的翻译。
该技术属于上述的PTGS 。
二、发现简史上个世纪末，反义RNA 作为一项基因治疗的新技术引起不少研究人员的兴趣，然而在一些实验中发生了一些有趣的现象：向细胞中导入与目的mRNA 序列相同的正义RNA 和与之互补的反义RNA 一样，可以产生阻断mRNA翻译的效果。
这与传统的反义RNA 技术相悖。
之后人们发现，将双链RNA （dsRNA ，由正义RNA 和反义RNA 结合而成）注入，诱发了比单独注入二者之一都要强得多的基因沉默。
之后也证实纯化的正义RNA 没有诱导作用，而反义RNA 的诱导作用也很小，而之前正义RNA 引发基因沉默的实验结果也被证实是由于其中受到了微量dsRNA 的污染。
（如右图T1、T2所示）T1（上）T2（下）三、原理与应用概述：细胞由于进化的机理，有一套降解双链RNA的酶系统（抗病毒感染）。
RNAi就是利用这一系统，人工引入一段和目标RNA互补的序列，这样，在细胞内形成双链RNA，诱发降解机制。
使目标RNA降解，无法被进一步翻译了。
具体过程：第一步（起始阶段）：是较长ds RNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。
RNA干扰技术的发展与应用
RNA干扰技术的发展与应用RNA干扰技术是一种基因功能研究和基因治疗的重要手段，也成为了生命科学领域的前沿技术。
该技术广泛用于细胞生物学、分子生物学、基因治疗等领域，被视为研究生物学、生物医学的重要突破。
本文将详细介绍RNA干扰技术的发展与应用。
一、 RNA干扰技术概述RNA干扰是指通过RNA分子介导的基因沉默。
RNA干扰技术是迄今为止最常用的方法之一，运用了生物细胞自身RNA不同的特性，通过RNA分子指导来沉默靶基因并影响基因表达，从而对细胞内的生物学过程进行调控。
RNA干扰技术具有难度低、重复性好、准确性高的优点，因此得到了广泛的应用。
二、 RNA干扰技术的发展历程RNA干扰技术的起源可以追溯到20世纪80年代初期的小RNA发现。
20世纪末的中期，Andrew Fire 和 Craig C. Mello 等科学家首次提出了RNA干扰现象的概念，并由此探索了该现象的机制和应用。
后来，RNA干扰技术逐渐成为生物学、分子生物学和基因治疗的研究热点，也成为了基因沉默领域的重要技术。
在RNA干扰技术的发展过程中，最初使用的是小分子RNA的工具。
随着基因组研究的发展，siRNA和shRNA作为转染RNA 干扰技术的重要工具也被广泛使用。
siRNA比shRNA短，因此更容易转染进入到细胞中；而shRNA则需要进入细胞并被加工成小RNA。
通过RNA干扰技术沉默基因的方式也在不断创新，例如CRISPR/Cas 系统等等。
三、 RNA干扰技术在基因医学中的应用RNA干扰技术在基因医学和基因治疗中的应用也越来越广泛，常常在抗癌治疗和遗传疾病等领域中得到应用。
RNA干扰技术具有局部作用、特异性、有效性高的特点，因此也是基因治疗中的重要手段。
以下是RNA干扰技术在基因医学中的应用之一:1. RNA干扰技术的用于癌症治疗在癌症的精确治疗研究中，人们通常将基因治疗技术与RNA干扰技术相结合，先进而有效地阻止了肿瘤的生长。
RNA干扰及其机制
RNA干扰及其机制RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种在真核生物中广泛存在的保守的基因调控机制。
它通过靶向特定的RNA分子，降低或抑制其转录或翻译，从而实现对基因表达的调控。
RNA干扰机制包括小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）和microRNA(miRNA)两种方式。
RNA干扰的机制主要涉及到siRNA和miRNA的合成、成熟和靶向调控过程。
siRNA是由外源RNA（如病毒RNA）或内源RNA（如转座子RNA）降解产生的小分子RNA，它与RNA诱导的沉默复合体（RISC）相结合，通过序列互补靶向其作用靶标RNA分子，导致靶标RNA的降解或翻译抑制。
miRNA则是内源性产生的一类小RNA，通过转录、剪切和成熟过程产生成熟miRNA，与RISC结合后，靶向调控多个mRNA的翻译。
在siRNA合成过程中，双链RNA（dsRNA）首先由核酸多聚酶复制或RNA转录过程产生，而在miRNA合成过程中，则由miRNA前体RNA经过外核脱去部分序列后产生。
这些长链RNA经过核酸酶Dicer酶的作用进一步加工成为长度约为21-23个核苷酸的双链小miRNA或siRNA。
miRNA与RNA诱导的沉默复合体（RISC）结合后，通过序列互补机制靶向特定的mRNA，从而发挥调控的作用。
RNA干扰的调控作用主要通过两种方式实现：一是通过mRNA的降解，siRNA或miRNA与RISC结合后，通过靶标mRNA上的完全或部分互补序列，引导RISC靶向特定mRNA上的区域，使该mRNA受到核酸内切酶的攻击，导致mRNA的降解；二是通过转录的翻译抑制，siRNA或miRNA与RISC结合后，通过靶标mRNA上的互补序列，抑制其翻译的发生，使得mRNA不能被核糖体识别和翻译出蛋白质。
在细胞中，RNA干扰不仅参与基因的调控，还参与到染色体剪接、DNA甲基化和染色质乃至整个基因组的稳定性调控中。
RNA干扰技术在生物体内的应用
RNA干扰技术在生物体内的应用RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）是一种通过RNA分子调节基因表达的技术。
这种技术起源于异国植物的抗病防御机制，后被研究人员应用到哺乳动物细胞中，并在基因研究、药物研发、治疗疾病等各个领域取得了重要进展。
本文旨在介绍RNA干扰技术在生物体内的应用，探讨这项技术的优势与局限性。
一、RNA干扰技术的基本原理RNA干扰技术是通过靶向特定mRNA分子实现基因的削减或关闭，进而影响目标蛋白的表达。
具体来说，RNA干扰技术通过产生一种小分子RNA分子——小干扰RNA（siRNA）或大干扰RNA（shRNA），并将其导入到细胞内，从而通过RNA识别机制与目标mRNA结合，形成RNA蛋白复合体，进而引起RNA分子酶的裂解和mRNA分子的降解，最终阻止目标基因的表达。
此外，RNA干扰技术还可以通过mRNA的特异结构域（例如5’端环状、内切酶切割位点等）或通过反义RNA，实现RNA的抑制。
相对于基因缺失或表达缺陷等传统技术，RNA干扰技术具有速度快、特异性高、可逆性强等优点，在生物学研究、药物筛选及治疗疾病等领域有着广泛应用。
二、RNA干扰技术在基因研究中的应用RNA干扰技术在基因研究中的应用主要包括以下几个方面：1. 基因靶向筛选和分析：RNA干扰技术可以通过对mRNA分子的靶向敲除，实现对基因功能的研究和分析。
例如，通过对某一靶向基因的干扰，可以对其功能的影响和调节机制进行深入探究。
2. 小分子药物筛选：RNA干扰技术可以用于大量基因的筛选和小分子药物的筛选。
通过对目标基因的干扰，可以筛选出对其有特异靶向性的效应子，进而开发出新型的小分子药物。
3. 基因治疗：RNA干扰技术可以通过切断特定mRNA分子，对致病基因进行基因治疗。
例如，在癌症研究中，RNAi技术被应用于抑制某些配体和激酶等蛋白质的表达，来达到治疗癌症的目的。
三、RNA干扰技术在药物研发中的应用RNA干扰技术在药物研发中是一种新型的生物分子靶向化技术。
小干扰RNA综述
小干扰RNA的设计方法及研究进展10药学01班20109830129 沈洪秀【前言】RNA干扰(R N Ai)在抵抗病毒感染抑制转座子活动调控内源性基因表达等方面发挥重要作用，其高特异性高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段。
本文简要概括R N Ai 作用机制和siRNA技术的原理, 同时也讨论了RNAi技术在各领域的应用。
【摘要】小干扰RNA(siRNA)是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的转录后基因调控方式,也是一种重要的研究工具大量的研究工作致力于设计合理的RNA片段用于基因功能研究,并将其作为一种治疗方法用于肿瘤病毒性疾病等基因治疗以及药物靶向研究.然而随机设计的RNA对靶点的沉默效应差别很大。
因此设计siRNA直接针对靶向基因的高效成为关键的问题。
生物信息学热力学计算，计算机辅助设计等方法和手段成为设计siRNA的新热点。
本文对设计siRNA原则及方法研究进行总结论述。
【关键词】RNA干扰；siRNA；在线设计；基因沉默；基因治疗；药物筛选；基因表达调控近年来研究表明[1], 引入双链RNA( double-strandedRNA, dsRNA)可以促使特定因的mRNA降解, 从而高效、特异地阻断体内特定基因表达, 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 此现象称为RNA干扰( RNA interference, RNAi)。
短链RNA干扰( short interferingRNAs, siRNAs)是引入dsRNA被Dicer酶(一种dsRNA特异的核酸内切酶, RNaseÓ家族中特异识别dsRNA的一员)切割形成的21~ 23核苷酸( nt)的短片段, 能够以序列同源相应的mRNA靶目标, 高度特异性降解靶目[2]。
以siRNAs为基础的基因沉默技术近年来发展迅速, 并成功地阻抑了疾病相关基因如病毒基因、原癌基因等; 成功构建的转基因动物模型,为高通量研究功能基因组学、药物筛选、基因治疗等提供了新途径。
RNA干扰及其机制
RNA干扰及其机制
RNA干扰是一种新型的基因表达调控机制，它可以通过调节基因间的相互作用，实现基因的表达调控。
RNA干扰技术包括很多不同的方法，其中包括siRNA、miRNA和RNA内切酶基因等。
这些技术在生物学中有着广泛的应用，可以用于研究和调控基因表达。
RNA干扰是一种自然调控机制，可以抑制或调节mRNA的表达，从而调节细胞中的基因表达。
最常见的RNA干扰技术是siRNA，它可以靶向特定mRNA的3'末端，促使其形成双链RNA，并最终抑制其功能。
siRNA的抑制机制是通过RNA-RNA互作的形式引起的，它会与特定mRNA结合，形成“siRNA-mRNA”复合物，并最终能够抑制mRNA的转录及翻译的过程，从而使基因表达受到抑制。
miRNA是一种特殊的小RNA分子，可以连接靶向mRNA的3'末端。
它能够通过与mRNA形成“miRNA-mRNA”复合物来调控mRNA的翻译，从而实现基因表达的调节。
虽然miRNA与siRNA的机制相似，但是它的作用原理有一定差异，miRNA通过调节mRNA的翻译来抑制基因表达，而siRNA则会直接破坏目标mRNA。
RNA内切酶基因是一种RNA干扰技术，它能够通过表达一种特殊的内切酶来抑制特定的mRNA。
它的原理是利用内切酶将特定的mRNA切割，从而使得目标基因不能被翻译，最终从而影响基因表达。
RNA干扰技术基本原理与应用
网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需再耗时 耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程
CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重组位点 Barcode：每个shRNA独特的识别序列 MSCV：病毒载体骨架 PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择 Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列
在特异性siRNA引入1~2个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG
目标序列筛选的相关网站
查找已经证实的siRNA的网站
siRNA的制备方法
体外制备方法
化学合成siRNA 体外转录获取siRNA 利用Dicer或 RNaseⅢ消化长的dsRNA成
RNAi的发现和发展历程
2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑
2004年 Morris 等 用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制
Science 2004(August 27)；305：1289-1292
RNAi的主要特点和优势
诱导转录后水平的基因沉默 具有高度的特异性 抑制基因表达的效率非常高 可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去
siRNA
化学合成法制备siRNA
优点： 纯度高 合成量不受限 能被标记 缺点：价格昂贵、合成周期长 用途：已经找到最有效的siRNA的情况下，
需要大量siRNA进行研究
体外转录法制备siRNA
优点：简单 成本低 速度快 毒性小 稳定性好 缺点：反应规模和量始终有一定的限制 用途：筛选siRNAs，特别是需要制备多种
HCV RNA ↓ 21倍
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RNAi研究及其进展公光业M110107259前言RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。
1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。
由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。
RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。
本文综述了该研究的最新进展。
正文RNAi的发现：上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。
最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。
他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。
此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。
1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现象称为消除作用(quelling或基因压制)。
1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。
这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。
1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。
从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。
RNAi作用机制:病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。
宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。
siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。
RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。
被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。
siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
RNAi 发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。
需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。
所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。
怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。
他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。
研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。
结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。
刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。
3 RNAi作用的特点3.1 高序列特异性RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，19nt 的dsNRA几乎可以完全抑制基因的表达,而将其中的1nt突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了，这种高度的序列特异性能够使dsRNA 能够非常特异地诱导与之序列同源的mRNA降解，避免降解与目的mRNA同家族的其他mRNA，从而实现对目的基因的精确沉默。
因此，RNAi具有重大的医学价值。
3.2高效性RNAi存在级联放大效应,由于Dicer酶切产生的siRNA与同源mRNA的结合并降解后者，产生新的siRNA，新产生的siRNA可再次与Dicer酶形成RISC复合体，介导新一轮的同源mRNA降解的多次利用，如此循环，使相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能产生强烈的NRAi效应(每个细胞仅需几分子siRNA就可产生RNAi效应)，并可达到缺失突变体表型的程度。
相比普通的siRNA，具有短发卡结构的双链RNA(short hairpin RNA,shRNA)产生的NRAi 效应更强。
3.3 RNAi抑制作用迅速RNAi基因的表达发生在转录后，通过细胞质中同源mRNA的快速降解，最终使该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。
3．4 RNAi作用的靶基因位点有选择性外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前体没有或很少具有影响，以内含子或启动子序列构成的外源dsRNA无法引起RNAi效应.3.5具有高稳定性与反义寡核昔酸不同,siRNA是3’端悬挂TT碱基的双链RNA,所以化学性质很稳定,无须像反义核昔酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。
3.6可传播性和可遗传性RNAi抑制基因表达的效应可以越过细胞界限，在不同的细胞间长距离传递和维持。
在线虫中干涉效应可以传递到子代，但这种遗传只限于子一代，子二代往往又恢复到野生型3.7 RNAi效应的依赖性只有连续输dsRNA，沉默效应才能持续下去，否则将产生短暂的沉默反应，而且这种效应的强度与初始dsRNA的浓度有关。
4 siRNA的设计与合成RNAi技术在基因功能研究，以至于基因治疗方面显示出巨大的前景。
双链siRNA的设计、合成是进行RNAi研究的关键。
根据目前发表的文献和一些实验经验，siRNA的设计可遵循以下几点进行: (1)选择以碱基A或G开始的91-12碱基大小的目的mRNA。
因为RNA polyMeraseⅢ启动子只有在第一个转录碱基是嘌呤时才能起作用。
（2）针对目的mRNA一般选择2-4个不同序列，CG含量为30%-50%，避免4个碱基T或A的连续序列，避免选择起始密码下游50-100碱基、终止密码上游100碱基以及5和3端的非编码区域，BLAST检查设计序列的特异性。
(3)设计适当的实验对照，比如设计有1-2个碱基错配的序列，或者是随机变更siRNA的碱基排列顺序。
siRNA的制备方法有体外制备和体内表达，前者是在体外制备siRNA，然后导入细胞，而后者则导入DNA使之在细胞内表达siRNA。
根据具体方法可进一步划分，下面分别予以介绍。
体外制备法包括：（1）化学合成这是最简单、快速的体外制备方法。
目前有许多基因公司能提供多种siRNA的合成，但其价格昂贵，不适合筛选siRNA等长时间的研究。
（2）体外转录通过合成得到DNA Oligo模版,应用试剂盒体外转录合成siRNA。
相对化学合成法而言,这是一种性价比高的筛选siRNA的好方法.体外合成法效率低,表达短暂,因此又发展了体内表达法。
（1）RNaseⅢ消化长片断双链RNA制备siRNA与其他制备方法相比,它不需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个最有效的siNRA。
它选择200-1000Pb的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片段的dsNRA，然后应用RNaseⅢ(或Dicer)在体外消化,得到一个siRNA的混合体,除去未消化的dsRNA后,将siRNA 直接转染细胞,它能保证目的基因被有效抑制。
（2）siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶Ⅲ启动子（polⅢ）中的一种(目前常用的是人源和鼠源U6启动子或者人源H1启动子),操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。
这种方法是合成2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火后，克隆到相应载体的pol Ⅲ启动子下游。
siRN表达载体的优点在于可以进行长期研究。
（3）siRNA表达框架siRNA表达框架(SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。
这个方法包括一个NRA polⅢ启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA polⅢ终止位点。
和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等的步骤,可以直接由PCR得到。
因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。
如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。
构建好的载体可以用于稳定表达siRN A和长效抑制的研究。
RNAi的应用RNAi在探索基因功能中的应用：人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。
阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。
在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。
由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。
同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。