RNA干扰实验
RNA干扰(RNA interference, RNAi)
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。
RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。
它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。
RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。
1 RNAi的历史背景20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。
而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。
当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。
1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。
而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。
他们将这一现象称为RNAi。
因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。
此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。
基因表达与调控实验
基因表达与调控实验基因表达与调控是生物学研究中的重要课题之一。
通过实验方法来研究基因的表达和调控机制，有助于深入了解生物体内基因功能的调节网络。
本文将介绍几种常见的基因表达与调控实验方法。
一、RNA干扰实验RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是通过利用双链RNA 抑制特定基因的表达的一种方法。
研究者可以合成特定基因的小干扰RNA（siRNA），将其转染到细胞中，从而降低或抑制目标基因的表达。
通过RNA干扰实验，可以研究目标基因的功能以及该基因对生物体内其他基因表达的调控作用。
二、转录组学研究转录组学是研究细胞或组织中所有转录产物（RNA）的总和，包括mRNA和非编码RNA。
通过高通量测序技术，可以获取细胞或组织中所有转录产物的信息，进而分析基因的表达模式和调控机制。
研究者可以通过比较不同条件下的转录组数据，识别出差异表达的基因，并推断这些基因在特定生物过程中的功能和调控作用。
三、染色质免疫共沉淀实验染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，简称ChIP）实验是一种研究蛋白质与染色质相互作用的方法。
通过将染色质与特定抗体结合，可以富集特定的染色质区域。
研究者可以使用ChIP实验来研究转录因子与染色质上的结合关系，进而揭示基因调控的机制。
四、质谱分析质谱分析是一种通过测量分子的质量和相对丰度来获得结构与组成信息的方法。
在基因表达与调控的研究中，质谱分析常用于鉴定和定量蛋白质样品中的修饰、亚型和互作分子。
研究者可以利用质谱分析研究蛋白质的后转录修饰现象以及蛋白质之间的相互作用，以此来推测基因调控的机制。
五、荧光成像技术荧光成像技术是通过标记基因或蛋白质，并利用激光和荧光显微镜等设备观察和分析其在细胞或组织中的分布和表达量。
通过荧光成像技术，可以研究基因的表达模式、定位与分布，并进一步了解其调控方式。
该技术在研究基因调控过程中具有很大的应用潜力。
试述rna干扰的原理和应用.
试述RNA干扰的原理和应用原理介绍RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种基因沉默的现象，通过转录后基因沉默的方式调控基因表达。
它在生物体内通过小分子RNA（siRNA和miRNA）介导的机制实现，可以靶向特定基因的mRNA并导致其降解或抑制转录，从而抑制目标基因的表达。
RNA干扰的主要原理是，由于siRNA或miRNA的序列与目标mRNA的序列互补配对，形成二重链结构，通过RNA诱导的沉默复合物（RISC）的介导，将目标mRNA特异性地降解。
RNA干扰可以发生在真核生物和原核生物的细胞内，包括植物、动物和微生物。
RNA干扰的应用RNA干扰在基因研究和生命科学领域有着广泛的应用。
下面以几个具体的应用为例进行介绍：1. 基因功能分析RNA干扰技术可以通过特异性地沉默特定基因的表达，来研究目标基因在细胞、组织或整个生物体中的功能。
通过沉默目标基因后的观察，可以推断该基因对特定生理过程或病理过程的影响，并进一步揭示基因功能的机制。
2. 新药研发RNA干扰技术可以用于筛选化合物或药物的靶点，从而加速新药的研发过程。
通过靶向关键基因的RNA干扰，可以模拟药物对这些基因的影响，从而评估化合物或药物的疗效和毒副作用。
这种方法可以减少药物研发的耗时和成本，提高药物筛选的效率。
3. 疾病治疗RNA干扰技术在疾病治疗方面有着巨大的潜力。
例如，通过沉默特定基因，可以抑制癌细胞的生长和扩散，从而实现肿瘤的治疗。
此外，RNA干扰还可以用于治疗病毒感染、传染性疾病和遗传性疾病等方面的研究和治疗。
4. 遗传改良RNA干扰可以通过抑制特定基因的表达，来改良农作物的性状和品质。
通过设计特异性的siRNA或miRNA，可以有效地抑制农作物中不良性状的表达，提高农作物的产量、抗病性和抗逆性。
RNA干扰的前景和挑战RNA干扰技术的广泛应用在生命科学和医学领域展现出巨大的潜力，但同时也面临着一些挑战。
其中主要的挑战包括：1.递送技术：RNA干扰技术需要将siRNA或miRNA送达到目标细胞或组织内，而递送技术仍然是一个难题。
实验报告： 线虫RNA干扰的基因沉默
实验一：线虫RNA干扰的基因沉默一、实验目的RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单而成为研究基因功能的有效手段。
我们利用表达tag-214 dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的。
二、实验背景RNAi是近年来以秀丽线虫的研究为基础而发展起来的一种基因knock down 技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。
三、实验原理通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。
在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。
当线虫以此大肠杆菌为食时，就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。
本实验将利用表达tag-214 dsRNA的大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的目的。
四、实验材料：1.秀丽线虫（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型）由于线虫的RNA的干扰操作简单快速，且重复性好，已成为鉴定基因功能以及基因间互相作用关系的有效材料。
秀丽线虫属于线性动物门，线虫纲，小杆线虫目，广杆线虫属。
秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。
秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。
雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。
其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。
如上左图为秀丽线虫的模式图（上为雌雄同体，下为雄性个体），右图为秀丽线虫的生活史。
线虫具有生活周期短，易培养和保存等优点，由于其身体透明，因此可以在显微镜下跟踪观察每个细胞的命运，是目前遗传学、发育学和细胞生物学研究的重要模式生物。
RNA干扰步骤范文
RNA干扰步骤范文RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过介导靶向mRNA的降解或抑制翻译的机制来沉默基因表达的方法。
RNAi技术因其高效、具有选择性和可逆性等特点，被广泛应用于研究基因功能和治疗疾病。
下面是RNA干扰的常规步骤。
一、设计siRNA序列siRNA（short interfering RNA）是RNAi中最常用的工具。
它们由20-25个碱基组成，包含正链和反链。
设计好的siRNA序列特异性地与靶向mRNA结合，从而引发RNAi反应。
siRNA序列可以来自基因序列，也可以使用在线工具进行设计。
二、纯化siRNA合成完的siRNA可能含有未反应完全的杂质。
常见的提纯方法有丝染和HPLC，用于去除杂质并保留合适的siRNA。
三、转染siRNA将siRNA引入靶细胞内是RNAi实验的一步关键。
目前常用的转染方法有离心转染、电穿孔法、磷脂体转染和病毒载体转染等。
选择合适的转染方法要考虑细胞类型、实验目的和资源的可用性。
四、评估RNA干扰效果为了确定RNAi的有效性，可以使用定量PCR、Western blotting和免疫细胞化学等技术来检测目标基因的表达水平。
同时，还可以使用质粒转染RNA干扰对照组进行比较。
五、验证RNA干扰效应验证RNA干扰效应可以通过细胞增殖试验和细胞凋亡分析等方法来确定，以进一步验证RNAi技术的可靠性和有效性。
六、RNA干扰后的功能研究七、RNA干扰的限制和改进尽管RNAi技术在研究和治疗领域有潜力，但也存在一些限制，如序列特异性和细胞内递送的问题。
为了克服这些限制，研究者们正在努力改进siRNA的设计和输送系统。
总结起来，RNA干扰的步骤主要包括设计siRNA序列、纯化siRNA、转染siRNA、评估RNA干扰效果、验证RNA干扰效应以及RNA干扰后的功能研究。
通过这些步骤，研究人员可以有效地沉默目标基因的表达，揭示其生物学功能和分子机制，为基因功能研究和疾病治疗提供重要的工具和思路。
RNA干扰技术的使用注意事项
RNA干扰技术的使用注意事项RNA干扰技术是一种常用的实验室技术，通过介导RNA降解或抑制RNA翻译来靶向调控基因表达。
这项技术在基因功能研究、药物研发以及治疗某些疾病中起到了重要的作用。
然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，我们需要遵循一些注意事项。
首先，合理设计实验方案。
RNA干扰可以通过不同的途径进行，包括siRNA、shRNA和miRNA等。
在选择特定的干扰方法之前，我们需要全面了解目标基因的结构、寡核苷酸序列以及该基因在细胞或组织中的表达模式。
此外，还应考虑到表达获得的合适载体、基因递送系统以及细胞系的选择。
合理而全面的设计是确保RNA干扰实验成功的关键。
其次，注意靶点的选择。
在设计RNA干扰实验时，正确选择靶点基因是非常重要的。
通常，选择靶点时最好选择编码蛋白质的区域，避免选择含有剪切位点的部分。
此外，还要确保选择的靶点是唯一的，避免干扰到其他相关的基因。
正确选择靶点可以避免误导实验结果和分析。
此外，注意使用适当的阳性和阴性对照。
阳性对照用于验证RNA干扰技术的有效性，而阴性对照则用于排除非特异性效应。
阳性对照可以是选择一些已经被证实具有RNA干扰效果的基因作为模板，而阴性对照可以是采用随机序列或不与任何基因相关的RNA片段。
同时，为了进一步验证RNA干扰的特异性，还可以设计siRNA或shRNA与目标基因不同区域的非特异性控制对照。
合适的阳性和阴性对照可以提高实验的可信度。
在实验过程中，注意合适的RNA浓度和转染条件是非常重要的。
RNA的浓度过高可能导致细胞毒性或非特异性效应，而浓度过低则可能导致RNA干扰效果不明显。
因此，我们需要优化RNA的浓度并进行细胞毒性测试，以确保使用的RNA 浓度在细胞中具有最佳的RNA干扰效果。
同时，也需要注意转染条件的优化，以确保RNA能够有效地被细胞吸收。
另外，合适的检测方法和时间点选择也是非常重要的。
常用的检测方法包括Western blotting、荧光素酶报告基因测定和实时定量PCR等。
RNA干扰技术原理及应用
03 rna干扰的应用
在医学领域的应用
01
02
03
疾病诊断
利用rna干扰技术，可以 特异性地沉默致病基因的 表达，从而实现对疾病的 诊断。
药物研发
通过rna干扰技术，可以 筛选出对特定疾病具有治 疗作用的候选药物，加速 药物研发进程。
基因治疗
rna干扰技术可以用于基 因治疗，通过沉默致病基 因的表达，达到治疗遗传 性疾病的目的。
功能基因组学研究
rna干扰技术可以用于功能基因组 学研究，通过沉默基因的表达， 探究基因的功能和作用机制。
生物进化研究
利用rna干扰技术，可以探究生物 进化过程中基因表达的变化和演 化机制。
生物医学研究
rna干扰技术可以用于生物医学研 究，通过沉默特定基因的表达， 探究疾病的发生和发展机制。
04 rna干扰技术的挑战与前 景
药物研发
RNA干扰技术也可用于药物研发，帮助科学家快速筛选 出与特定疾病相关的基因，从而开发出新的药物。
农业应用
在农业领域，RNA干扰技术可用于培育抗病、抗虫的转 基因作物，提高农作物的产量和品质。
05 rna干扰技术的实验流程
设计siRNA
总结词
设计siRNA是RNA干扰技术的关键步 骤，需要选择与目标mRNA互补的特 定序列。
技术挑战
脱靶效应
RNA干扰过程中，有时会导致非目标基因的表达沉默，这被称 为脱靶效应。脱靶效应的产生可能与siRNA的序列、浓度以及
作用时间等因素有关。
细胞毒性
某些RNA干扰试剂可能对细胞产生毒性，影响实验结果。因此 ，在选择RNA干扰试剂时，需要考虑其对细胞的毒性。
体内应用限制
在体内应用RNA干扰技术时，如何将siRNA有效地传递到靶细 胞中是一个挑战。此外，如何维持siRNA的稳定性以及其在体
rna干扰技术原理
rna干扰技术原理
RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过引入
外源RNA来抑制特定基因表达的技术。
RNA干扰技术的原理
主要包括两个步骤：合成siRNA和介导降解mRNA。
在第一个步骤中，dsRNA（双链RNA）的一部分被切割成小
片段，称为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。
这些siRNA由一段约20个碱基对的双链RNA组成，其中一
条链具有与目标基因序列完全互补的序列。
这些siRNA可以
由人工合成的dsRNA或通过特定的酶反应产生。
在第二个步骤中，siRNA与RISC（RNA-induced silencing complex）结合形成RISC-siRNA复合物。
RISC是一种多聚体
蛋白质复合物，能够识别和结合siRNA。
RISC-siRNA复合物
通过siRNA的互补序列与目标mRNA的特定区域结合，导致mRNA被降解。
这样，目标mRNA的翻译过程受到抑制，从
而减少了目标基因的表达。
通过这种方式，RNA干扰技术可以干扰特定基因的表达，从
而研究和探索基因功能。
在实验室中，研究人员通常会将人工合成的siRNA引入到细胞中，以降低或抑制目标基因的表达。
这种技术在基因功能研究、新药研发和基因治疗等领域具有广泛的应用前景。
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RNA干扰实验一、磷酸钙转染法【实验原理】磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。
磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。
该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。
（二）材料呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3CsCl纯化的表达质粒DNA（三）试剂1．完全培养液DMEM 90mlFCS 10ml2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用3．2×HEBS (g/500ml)NaCl 8.0KCl 0.38Na2HPO4.7H2O 0.19HEPES 5.0葡萄糖1.0用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。
【方法与步骤】1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞第二天进行转染2．准备CaPO4沉淀2.1 准备两组试管在A管中加入：15μg质粒DNA69μl 2M CaCl2460μl重蒸水在B管中加入：550μl 2×HEBS2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。
3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。
4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。
6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。
【注意事项】1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
2．在实验中使用的各种试剂都必须小心校准，保证质量。
3．质粒DNA 需CsCl纯化，乙醇沉淀后的DNA应保持无菌，在无菌水或Tris- EDTA中溶解。
4．沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地黏附和进入细胞。
二、电穿孔和电融合技术[实验原理]当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。
运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。
作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。
与其他常用的导入外源物质的方法相比，电穿孔具有很多优点。
首先，不必象显微镜那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。
第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。
第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。
实际上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。
除了能使细胞膜具有通透性，让外界的分子扩散入胞液中以外，高强度的电场脉冲也能引起细胞融合，这一现象叫做电融合。
然而，在用电脉冲融合前必须使细胞相互紧密接触，这一电融合方法在原生质融合制取杂交植物，胚胎细胞相互融合制备动物克隆方面非常有用，尤其在制取杂交瘤细胞制备单克隆抗体方面用处很大。
几个实验室已证明使用电场电融合效率比常规的化学融合方法高10到100倍，最近，贴壁细胞的电融合还被用来研究细胞融合时细胞的骨架成分和细胞器的动力学重排。
[仪器、材料和试剂]（一）仪器：脉冲发生器，样品池：一个盛细胞的容器和两个平行的金属电极，CO2培养箱，离心机，显微镜，微量移液器，镊子，剪刀，三角瓶，吸管，毛细管，离心管等。
（二）材料：（三）试剂：穿孔介质（PM）：15mmol/L磷酸钾1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇）10mmol/L HEPES 调节pH至7.3融合介质（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇2mmol/L HEPES 调节pH至7.3[方法与步骤]一．悬浮细胞的电穿孔法：1电穿孔进行基因转移电穿孔可用于将多种不同类型的分子载入活细胞中，操作步骤非常相似。
以下我们用基因转移作为例子。
载入其他的分子可按以下相同步骤进行，只需把外源DNA换页所需分子即可。
1.1 使细胞在适宜的培养基中生长，用胰酶处理，收获对数生长中期的细胞，并用腺酶处理。
1.2 在穿孔介质（PM）中至少洗一次。
洗细胞时，在台式离心机上1000rpm离心3分钟，使得悬浮细胞沉降。
然后，去掉上清液，在新的介质中重新悬浮细胞。
1.3 计数细胞，在PM中，浓缩细胞为大约1千万细胞/ml。
1.4 将DNA加到细胞悬液中，充分混合，使DNA均匀分散，用吸管吸一定体积的细胞-DNA混合液到装有电极的灭菌小样品池中。
1.5 在电穿孔装置上设置输出电压和脉冲宽度（脉冲宽度是指数衰减函数的时间常数，即τ=RC，C是电容，R是样品的电阻）。
假如设备是CD脉冲型发生器，设定电容和并联电阻，以达到合适的τ值。
1.6 将小池放进盛样品的池中，启动电穿孔装置，供给所需的电脉冲。
1.7 电处理后，向小池加1ml普通培养基，将细胞混合液从小池转移到组织培养容器（培养皿或培养孔）中，再加入一些培养基使最终的培养基体积适量。
然后，将样品细胞放回孵育箱中使之在正常条件下生长。
1.8 在测定转移基因的表达量前电穿孔细胞各自培养的时间不同。
2检测电穿孔效率和细胞存活率2.1 除用罗丹明偶联葡聚糖（1mg/ml）（分子探针）代替DNA外，将罗丹明偶联葡聚糖引入目标细胞的方法如前所述。
2.2 电穿孔后，用培养基洗涤细胞两次，去掉胞外的荧光葡聚糖。
2.3 电穿孔后30min，向细胞悬液中加30μl台盼蓝，孵育2min，然后用培养基洗涤。
2.4 在1000rpm下离心3min，收集细胞，将细胞重悬于PM中，终体积100μl。
2.5 将一滴细胞液（30μl）置于干净载玻片上，用盖玻片盖好，在显微镜下检测细胞，测定摄取荧光标记葡聚糖的百分数。
2.6 在亮视野镜片下，死细胞可因染成蓝色检测出（摄取了台盼蓝），测定细胞存活的百分数。
2.7 在各种电场设定值下重复实验，画出摄取葡聚糖率和细胞存活率对电穿孔参数的曲线。
这一曲线就将显示对特定细胞类型电穿孔的最优条件。
二．悬浮生长细胞的电融合融合悬浮细胞的步骤与电穿孔的很类似，只是在进行高强度的电场脉冲前后，必须用低幅、高频电场使细胞排成一条链。
1 用融合介质（FM）洗悬浮细胞两次，然后悬于FM中。
洗涤细胞时，在台式离心机上1000rpm下离心3分钟，得到细胞沉淀，弃去上清液将细胞悬于新鲜FM介质中。
2 将悬浮细胞转移到相应的融合室内。
假如要使两种不同的细胞彼此融合，转移前要充分混合。
3 启动介电电泳场，其振幅通常小于200V/cm，频率在2MHz以内，用显微镜检测细胞是否排成一条链，调节振幅和频率以达到最佳效果。
4 让介电电泳场开约1分钟后关掉，立即应用融合脉冲，其振幅数量级为1kV/cm。
脉冲宽度小于1ms。
在进行融合脉冲后立即再次启动介电电泳场，常规让其开启约2分钟。
5 关掉介电电泳场，让细胞在样品池中静置10分钟。
6 去掉FM，用普通培养基再次洗涤细胞。
7 将细胞转移到培养皿，加入普通培养基，在培养箱一般条件下培养。
[注意事项]1 最优组分依使用的特定细胞种类而有明显的变化。
如果努力优化电压和脉冲宽度电穿孔结果仍不令人满意，就应尝试改变穿孔介质。
2 影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关，为达到最高效率，必须收集对数生长中期的细胞。
1.纯化siRNA在转染前要确认siRNA的大小和纯度。
为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。
注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
2.避免RNA酶污染微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。
由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性通常，健康的细胞转染效率较高。
此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。
为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4.避免使用抗生素抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。
有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。
这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。
5.选择合适的转染试剂针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。
6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。
将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。
过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
7.通过标记siRNA来优化实验荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。
标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
RNAi研究的一般技术路线是：。