(整理)rna干扰.
RNA干扰(RNA interference, RNAi)
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。
RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。
它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。
RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。
1 RNAi的历史背景20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。
而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。
当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。
1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。
而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。
他们将这一现象称为RNAi。
因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。
此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。
RNA干扰技术的实验技巧与常见问题解答
RNA干扰技术的实验技巧与常见问题解答RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种重要的分子生物学研究技术，广泛应用于基因功能分析、疾病治疗等领域。
在RNA干扰实验中，研究人员可以通过引入特定的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或微小核糖核酸（microRNA，miRNA）来抑制或沉默目标基因的表达。
本文将介绍RNA干扰实验的一些关键技巧，并回答一些常见问题，旨在帮助读者更好地开展RNA干扰实验。
一、实验技巧1. 选择合适的靶基因和控制组在进行RNA干扰实验之前，首先需要确定要研究的靶基因。
该靶基因最好具有研究价值，并且对其功能了解较少。
同时，为了验证RNA干扰的特异性和效果，还需要设计合适的阴性对照组和阳性对照组。
阴性对照组可选择与靶基因序列无关的小干扰RNA或一个无关的基因作为靶点；阳性对照组则可选择确切知道RNA干扰会对其表达产生影响的基因。
2. 合理设计siRNA或miRNA序列在设计干扰序列时，可使用在线生物信息学工具或商业公司提供的设计工具，遵循以下原则：a）长度通常为19-23个核苷酸，一般选择21个核苷酸长度；b）确保序列中包含稳定的核苷酸序列，以提高干扰效果；c）避免序列与其他基因有任何类似区域，以确保干扰的特异性。
3. 选择适当的转染试剂与条件RNA干扰实验中常用的转染试剂包括化学法、电转法和病毒载体转染法。
在选择转染试剂时，需根据实验的需求和细胞类型进行选择。
另外，转染条件的优化也很关键，如浓度、时间和转染温度等，可对不同细胞类型进行优化。
4. 时间点和干扰效果的监测RNA干扰的效果通常在转染后24-72小时达到峰值，但不同细胞类型和靶基因可能有所不同。
因此，在进行RNA干扰实验时，需对不同时间点进行监测，以确定最佳时间点。
常用方法包括荧光显微镜观察siRNA或miRNA的共转染效率、Western blot或RT-qPCR检测蛋白质或基因的表达水平。
RNA干扰的调控机制
RNA干扰的调控机制RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种在真核生物中广泛存在的基因表达调控机制。
它通过靶向特定的mRNA分子，引导降解或抑制其翻译过程，从而调控基因表达。
RNA干扰的调控机制包括小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和microRNA（miRNA）两种方式。
一、小干扰RNA（siRNA）小干扰RNA（siRNA）是由外源或内源产生的一类双链RNA分子，具有21-23个核苷酸的长度。
siRNA的产生经历了如下步骤：首先，双链RNA被核酸酶III酶切割成长度约为70nt的前体miRNA（pre-miRNA）；然后，通过核酸酶Dicer酶作用下，pre-miRNA进一步被切割成21-23nt的siRNA；最后，siRNA与RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合形成RISC-siRNA复合体。
RISC-siRNA复合体与靶向mRNA结合，并通过RISC中的Argonaute蛋白族调控靶向mRNA的稳定性和翻译活性。
siRNA会导致靶向mRNA的降解或抑制其翻译，从而起到调控基因表达的作用。
二、microRNA（miRNA）microRNA（miRNA）是内源产生的一类小RNA分子，具有18-25个核苷酸的长度。
miRNA的产生与siRNA类似，经历了与siRNA相似的加工过程。
首先，一段长度为数百到数千个核苷酸的DNA序列被转录生成初级miRNA（pri-miRNA）；然后，pri-miRNA经过Drosha酶和Dicer酶的切割，形成成熟的miRNA；最后，miRNA与RISC结合形成RISC-miRNA复合体。
RISC-miRNA复合体可以与mRNA的3'非翻译区域（3' UTR）结合，抑制目标mRNA的翻译或加速其降解。
三、RNA干扰的调控网络RNA干扰不仅仅是一种基因表达调控机制，还参与了广泛的细胞信号调控网络。
rna干扰
RNA干扰什么是RNA干扰？RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过特定的RNA分子干扰基因表达的现象。
这种现象最早被发现于植物和线虫中，后来发现在动物中也普遍存在。
RNA干扰通过介导mRNA的降解或抑制转录来实现靶向基因的沉默。
RNA干扰的机制主要是通过一种特殊的小RNA分子，称为干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或小干扰RNA （short interfering RNA，shRNA）。
这些siRNA或shRNA是由外源性或内源性的长双链RNA在细胞内被核酶Dicer切割而成的20-30个碱基的双链RNA分子。
RNA干扰的过程RNA干扰的过程可以分为三个主要步骤：siRNA的产生、siRNA的引物和RNA诱导沉默复合物（RISC）的形成、RISC 介导的mRNA降解或转录抑制。
首先，外源性或内源性的长双链RNA被核酶Dicer切割成20-30个碱基的siRNA。
siRNA由RNA诱导沉默复合物（RISC）捕获，其中的一个链被释放，留下一个导引链和一个剪切链在RISC中。
接下来，导引链将与靶标mRNA互补结合。
RISC将靶标mRNA切割成小片段，导致mRNA的降解或转录抑制。
这种RNA干扰过程可以非常特异地沉默特定的基因表达。
RNA干扰在基因研究中的应用RNA干扰已经成为基础科学研究和功能基因组学研究中广泛应用的工具。
通过沉默特定基因的表达，研究人员可以揭示该基因在生物学过程中的功能，以及该基因对疾病发展的影响。
在细胞水平上，RNA干扰可以用于验证候选基因是否在特定生物途径中起关键作用，或者用于筛选新药物靶点。
研究人员可以通过转染siRNA或shRNA来干扰目标基因，评估其对细胞功能的影响。
在动物模型中，RNA干扰可以用于研究特定基因的作用。
通过通过siRNA或shRNA直接注射进入动物体内，可以沉默目标基因的表达，并观察动物表型的变化。
rna干扰的基本原理
rna干扰的基本原理RNA干扰技术是一种特殊的基因沉默技术，它通过人工合成的小干扰RNA（siRNA）或长干扰RNA（shRNA）引导RNA诱导靶向性降解特定基因的mRNA，从而达到抑制或沉默该基因表达的目的。
RNA干扰技术的发现和应用，为基因研究和基因治疗等领域提供了一个强有力的工具。
以下为RNA干扰的基本原理。
RNA干扰分为两种类型，分别是siRNA干扰和shRNA干扰。
首先是siRNA干扰，其中“si”指短干扰RNA。
干扰RNA在合成后，将被分解成21-23个碱基对的双链RNA，其中一个链称为“导引链”，该链的末端含有两个双脱氧核苷酸，为其引导RNA诱导靶向性降解目标mRNA提供了稳定性和特异性。
另一个链称为“反义链”，是导引链的完全互补，在小干扰RNA中起到了次要的配对作用。
在siRNA寻找目标时，导引链与目标mRNA的特定序列互相配对，而反义链与目标mRNA的另一段互补，最终引导该目标RNA被RNA酶切割。
其次是shRNA干扰，其中“sh”指短发夹RNA。
shRNA序列比siRNA序列长，例如，shRNA可以含有数百个核苷酸。
RNA干扰具有持续的靶向基因沉默作用，可以通过载体转导到目标细胞，并成为RNA酶III的底物，从而形成长时间的干扰效应。
shRNA启动子构成了RNA多聚酶III识别的序列，包括人类U6和霉红菌H1等次要RNA启动子。
shRNA被RNA聚合酶III识别和切割，将shRNA转化为短干扰RNA，它们寻找目标RNA，最终被RNA酶切割。
下面是RNA干扰的应用：RNA干扰应用广泛，比如应用于生物学基础研究、基因治疗、农业等领域。
在生物学研究中，使用RNA干扰可以比较准确地测量基因的功能，识别重要基因的突变，并清楚地了解它们的作用。
在基因治疗中，RNA干扰可用于治疗包括癌症、心血管疾病、自身免疫疾病和病原体感染等疾病。
在农业领域中，可使用基于RNA干扰技术的生物农药来控制有害生物的数量，并增加作物的产量和耐性。
rna干扰技术的原理与应用
rna干扰技术的原理与应用RNA干扰技术是一种基因沉默技术，它通过RNA分子的介入来抑制特定基因的表达。
RNA干扰技术的原理是利用小分子RNA分子（siRNA）或长分子RNA分子（shRNA）干扰靶基因的转录或翻译，从而实现基因沉默。
RNA干扰技术的应用非常广泛，包括基因功能研究、疾病治疗、农业生产等领域。
RNA干扰技术的原理RNA干扰技术的原理是基于RNA分子的介入来抑制特定基因的表达。
RNA干扰技术主要分为两种类型：siRNA和shRNA。
siRNA是由21-23个核苷酸组成的双链RNA分子，它可以与靶基因的mRNA分子结合并切断它，从而抑制靶基因的翻译。
shRNA是由数十个核苷酸组成的长链RNA分子，它可以在细胞内形成一个RNA-蛋白质复合物，从而抑制靶基因的转录。
RNA干扰技术的应用RNA干扰技术的应用非常广泛，包括基因功能研究、疾病治疗、农业生产等领域。
基因功能研究RNA干扰技术可以用于基因功能研究。
通过RNA干扰技术可以抑制特定基因的表达，从而研究该基因在细胞或生物体中的功能。
这种方法可以帮助科学家们更好地理解基因的功能和调控机制，为研究疾病的发生和治疗提供基础。
疾病治疗RNA干扰技术可以用于疾病治疗。
通过RNA干扰技术可以抑制疾病相关基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
例如，RNA干扰技术可以用于治疗癌症、病毒感染等疾病。
此外，RNA干扰技术还可以用于制备基因治疗药物，为疾病治疗提供新的思路和方法。
农业生产RNA干扰技术可以用于农业生产。
通过RNA干扰技术可以抑制植物中的特定基因的表达，从而改变植物的性状，提高植物的产量和质量。
例如，RNA干扰技术可以用于改良水稻、小麦等作物的性状，提高作物的产量和抗逆性。
总结RNA干扰技术是一种基因沉默技术，它通过RNA分子的介入来抑制特定基因的表达。
RNA干扰技术的应用非常广泛，包括基因功能研究、疾病治疗、农业生产等领域。
RNA干扰技术的发展为基因研究和疾病治疗提供了新的思路和方法，同时也为农业生产提供了新的技术手段。
RNA干扰 (RNA interference ,RNAi)
二、RNAi作用机制
当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切 酶（ Dicer ）识别，切割成 21-23 核苷酸长的小片 段，这些片段可与该核酸酶的 dsRNA 结合结构域结 合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后， mRNA 与 dsRNA 的有义链发生链互换，原 先 dsRNA 中的有义链被 mRNA 代替，从酶 -dsRNA 复合 物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对 mRNA进行切割，这样又产生了 21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合 物，继续对目的 mRNA进行切割，从而使目的基因沉 默，产生RNAi现象。
三、RNAi研究的一般技术路线
1、siRNA 的设计
何为siRNAs
siRNA
（ small interfering RNAs ， siRNAs ） 即为能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标并 将其降解而介导 RNA 干扰途径的短片断双链 RNA分子。
一般设计原则
（ 1 ）从 mRNA 的 AUG 起始密码开始，寻找“ AA” 二连 序列，并记下其 3' 端的 19 个碱基序列，作为潜在 的 siRNA 靶位点。有研究结果显示 GC 含量在 30%— 50% 左右的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更为有效。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或 者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他 编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因 需要设计 4-5 个靶序列的 siRNA ，以找到最有效的 siRNA序列。
RNAi 的基本过程：
siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能 量；
RNA干扰与基因沉默
RNA干扰与基因沉默RNA干涉（RNA interference，简称RNAi）是一种通过沉默特定基因表达的现象。
它是由于小分子非编码RNA（ncRNA）分子的介入而引发的一系列生物学过程。
RNA干涉广泛应用于基因功能研究、疾病治疗以及农作物改良等领域。
RNA干涉的机制主要涉及到两种类型的RNA分子：小干扰RNA （small interfering RNA，简称siRNA）和微RNA（microRNA，简称miRNA）。
这两种分子的共同特点是长度约为20-25个核苷酸，能与特定的mRNA序列互补配对，并导致靶基因表达的沉默。
在RNA干涉过程中，主要存在三个关键步骤：siRNA的合成、加载到RNA诱导靶向剪切复合体（RISC）中、靶基因的沉默。
第一步，siRNA合成。
在细胞质中，长的双链RNA由核酸酶Ⅲ酶降解为短的双链siRNA分子，通常由RNA多聚酶Ⅲ催化相关的siRNA 基因转录产生。
第二步，siRNA加载到RISC中。
一旦合成的siRNA进入细胞质，它与蛋白质复合物RISC结合，形成功能活性的RISC复合物。
第三步，靶基因的沉默。
RISC复合物中的siRNA导致RISC识别和结合到与其相互互补的mRNA分子上。
一旦结合，RISC复合物通过两种不同机制沉默靶基因：剪切降解和抑制转录。
-剪切降解是通过RISC复合物的核酸酶活性导致靶mRNA的剪切断裂。
这使得mRNA不能被翻译为蛋白质，并最终导致靶基因表达的沉默。
-抑制转录是通过RISC复合物的与靶mRNA结合，阻碍mRNA与翻译机器结合，从而抑制mRNA的转录过程。
RNA干涉在基因功能研究中起着重要的作用。
通过RNA干涉技术，研究人员可以选择性地抑制特定基因，观察沉默基因后细胞或生物个体的表型变化，从而推断该基因在生物过程中的功能。
在疾病治疗方面，RNA干涉也被广泛应用。
研究人员通过设计特异性的siRNA，可选择性地沉默与疾病相关的基因表达，如癌症相关的基因等。
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RNA干扰（RNAi）实验原理与方法近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RN A(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。
这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为R NA干扰（RNAi）。
一、RNAi的分子机制通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。
在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。
证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。
激活RISC需要一个A TP依赖的将小分子RNA解双链的过程。
激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。
尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。
另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt 长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.二、如何进行RNAi试验(一)siRNA的设计1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：/business/products/order2.htm/techlib/misc/siRNA_finder.html/Stu/shilin/rnai.html/rnadesign/default.aspx?SID=453587102.RNAi目标序列的选取原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
有研究结果显示GC含量在4 5%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated re gions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。
例如使用BLAST（/BLAST/）(3)选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3.阴性对照一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。
通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到：/catalog/category.aspx?key=49/techlib/tb/tb_502.html/mmcmanus/www/siRNADB.html/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Categor y=Published(二)siRNA的制备目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNa se III 类降解(e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siR NA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRN A。
体外制备1.化学合成许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。
主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。
由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素2.体外转录以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。
不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。
而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。
值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。
长期研究。
3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。
而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。
选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。
在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA 混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。
由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。
不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。
现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗体内表达前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。
而采用siR NA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。
这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
4. siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpi n RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。
这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。
之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。
要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。
由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
5. siRNA表达框架siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNApol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III 终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。
和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。
因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。
如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。
构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子不适用于：长期抑制研究。
（如果克隆到载体后就可以了）(三)siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。