FA-VD-105 稀苯扎溴铵溶液微生物限度检查方法验证方案
最新版中国药典微生物限度检查方法验证方案
最新版中国药典微生物限度检查方法验证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC 组签名：日期：审核部门：QC组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01 质量部下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00 按GMP（2010年修订版）要求新制定2015.10.22目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。
通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。
人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。
甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。
本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。
本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
0.2%苯扎溴铵溶液消毒效果验证
[3] 吴烈钧. 气相色谱检测方法[M]. 北京：化学工业出版社，2001： 191-192.
食品与药品 Food and Drug 2010年第 12卷第11期
431
东医疗器械）；YX-400B不锈钢双层立式蒸汽压力消 毒器（上海三申）。 1. 2 用具
QU Jian-quan, QU Jing, SONG Xiao-hong, LI Mei-yan (Shandong Freda Biopharm Co., Ltd., J inan 250101, China) Abst r act: Obj ect ive To validate the disinfectant effi cacy of 0.2% bromogeramine solution. M ethods The quantitative suspension test was carried out to validate the disinfectant efficacy of 0.2% bromogeramine solution for Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, respectively. Result s The three tests showed the sterilization rates of 0.2% bromogeramine solution for Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans were all greater than 99.9%. Conclusion The 0.2% bromogeramine solution can be used for the disinfection of bacteria and fungi. Key Words: bromogeramine; disinfection; sterilization rate
苯扎溴铵检验操作规程
4含量测定
4.1试剂与仪器
4.1.1纯化水，氢氧化钠试液4.1.2溴酚蓝指示液
4.1.3氯仿4.1.4电子天平(万分之一克)
4.1.5具塞锥形瓶4.1.6移液管(1ml，2ml，10ml)
4.1.7滴定管(50ml)4.1.8四苯硼钠滴定液(0.02mol/L)
4.2检验步骤
取本品约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50ml与氢氧化钠试液1ml，摇匀，加溴酚蓝指示液0.4ml与氯仿10ml，用四苯硼钠滴定液(0.02mol/L)滴定，将近终点时必须强力振摇，至氯仿层的蓝色消失，即得。每1ml四苯硼钠滴定液(0.02mol/L)相当于7.969mg的C22H40BrN。
3.2.2非季铵类物： 取本品4.0g加水溶解并稀释至100ml，量取25.0ml，置分液漏斗中，加氯仿25ml与氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)10ml，精密加入新制的5%碘化钾溶液10ml，振摇，静置使分层，分取水层用氯仿振摇洗涤3次，每次10ml，弃去氯仿层，水层加盐酸40ml，放冷，加50%溴化钾溶液40ml，用碘酸钾滴定液(0.05mol/L)滴定至淡棕色，加氯仿2ml，继续滴定并剧烈振摇至氯仿层红色消失；另量取上述剩余的水溶液25.0ml，置分液漏斗中，加氯仿25ml与盐酸滴定液(0.1mol/L)10ml，照上述方法，自“新制的5%碘化钾溶液10ml”起，依法测定。前后两次消耗的碘酸钾滴定液（0.05mol/L）之差，不得大于0.5ml为符合规定。
2．鉴别
2.1试剂与仪器
2.1.1硫酸，硝酸钠2.1.2纯化水，锌粉
2.1.3亚硝酸钠溶液(5%)2.1.4碱性β-荼酚试液
最新微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案六、验证内容1.供试液的制备1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。
1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。
1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。
备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
2.菌液制备2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30〜35℃培养18～24小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、、、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。
2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25℃培养2～3 天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。
2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，使大量的孢子成熟。
加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。
2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存有效期内使用。
消毒剂微生物限度检查方法验证方案
河北瑞晶康生物科技有限公司//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////编码：VAP-MV-QC09版本号：00题目：消毒剂微生物限度检查方法验证方案页码：1/27题目：消毒剂微生物限度方法验证方案起草人起草日期批准人批准日期颁发部门生效日期领用部门复印号分发部门审核小组成员河北瑞晶康生物科技有限公司//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////编码：VAP-MV-QC09版本号：00题目：消毒剂微生物限度检查方法验证方案页码：2/27文件修订史：版本号变更xx→xx修订人原版失效日期新版生效日期修订原因修订内容-原版新版对比备注题目：消毒剂微生物限度检查方法验证方案页码：3/27正文：★ 目的为了建立消毒剂的微生物限度检查方法，确认该方法适合于消毒剂的细菌、霉菌、酵母菌。
照此检查法和检验条件进行消毒剂细菌、霉菌、酵母菌能保证检验结果的准确、可靠。
★ 适用范围适用于消毒剂的微生物限度检查方法的验证。
★ 职责1.验证领导小组职责1.1 负责验证方案的审批。
1.2 负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。
1.3 负责验证数据及结果的审核。
1.4 负责验证报告的审批。
1.5 负责再验证周期的确认。
2.机械动力部职责2.1 负责组织试验所需仪器、设备的验证。
2.2 负责仪器、仪表、量具等的校验。
3.质量控制部/质量保证部职责3.1 负责拟订验证方案。
3.2 负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。
3.3 负责取样及对样品的检验。
3.4 负责收集各项验证、试验记录，并对试验结果进行分析后，起草验证报告，报验证领导小组。
★ 描述概述：微生物限度检査法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
(完整)FA-VD-101 复方碘溶液微生物限度检查方法验证方案
复方碘溶液微生物限度检查方法验证方案1目的根据《中国药典》2015版草案中的相关规定，建立复方碘溶液的微生物限度检查方法，并对其进行验证,保证其检验方法的科学性，使检验结果准确可靠。
2范围本验证方案适用于复方碘溶液的微生物限度检查方法的验证。
3人员与职责质量控制人员负责验证方案与报告的起草,并按照批准的方案实施，完成检验相关数据的采集；质量保证人员负责验证方案和报告的审核；质量管理负责人负责验证方案和报告的批准.4培训本方案实施前应对参加验证人员进行培训，并做好培训记录确保进行验证的人员均能熟悉、掌握验证过程。
5验证方案5.1制剂信息复方碘溶液为碘在碘化钾的助溶作用下溶于水中配制而成，处方中含有的碘有一定的抑菌作用，临床常作为口服补碘剂使用.其质量标准中规定应进行微生物限度检查,每1ml样品中细菌数不得超过100cfu，霉菌和酵母菌数不得超过100cfu，并不得检出大肠埃希菌.根据以上特点，本方案中按《中国药典》2015版草案《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》（1105)和《非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法》（1106）中相关要求，决定采用稀释剂制备成1﹕10的供试品溶液；采用平皿法中的倾注法对供试品中的需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数进行计数，根据草案对其质量标准中规定的大肠埃希菌进行检查，并对所选用的计数和检查方法进行验证。
5.2微生物限度检查法概述5.2.1微生物限度检查法系检查非灭菌制剂及其原料药、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查。
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
5.2.2微生物计数试验和控制菌检查试验应在受控洁净环境下（D级）的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出.单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
16种中成药微生物限度检查法的方法验证
我们对 ２ ０ ０ ５版药典拟 收载 的几种 中成药 品种微 生物
限度检查法进行方 法验证 ， 为规 范 中成药 的微 生物 限度检 查法提供科学依据 。
１ 材 料 和 方 法 １１ 材 料 ．
１２ １ 菌 液的制备 ： ．． 取经 ３ ７℃培 养 ｌ ～２ ， ８ ４ｈ 金黄色葡萄 球菌 、 大肠杆菌 、 枯草杆 菌 肉汤培 养基 １ｍＬ及 ２ ０～２ ５℃ 培养 ｌ ～２ ８ ４ｈ的白色念珠菌 真菌液体培养 物 ＋９ｍＬ生理 盐水为 ０倍稀释 ， 以此类推 ， 释到 ｌ ～ｌ １为 ５ ～１０ 稀 ０ ０ ０ ０ 个／ ｍＬ做活菌计 数备用 １２ ２ 供试液制备 ： ．． 各种 样品浓度均为 １ １ ：０供试液 ， 分别 加入上述 ４种试 验菌株 。 １２ ３ 培养基稀释法 ： 用 １ＨＬ供 试液 加 ３个平皿 或 ５ ．． 采 ｌ 个平皿 ， 每个平皿 加 １ ～２ ５ ０ｍＬ琼 脂 培养 基做 细 菌计 数 ， 测定 回收率 。 １ ３ 回收率测 定 ．
１ １ １ 仪器 设备 ： ．． 净化 工作 台 、 恒温 培 养箱 （ ０ ５℃ ） ３ ～３ 、
生化培养箱 （ ５ ８℃ ）微 波炉 、 氏振荡仪 、 温 水浴 、 ２ ～２ 、 康 恒 电热干燥 箱（ ５ ３０℃ ） 电冰箱 。 ２０ ５ 、
１ １２ 玻璃器皿 ： ．． 锥形瓶（ ５ ～３０ｍＬ 、 ２ ０ ０ ） 平皿 （ ｒ） 量 ９ｃ 、 ｎ
验 中加 入活菌个数为 ５ ～１０ ｃ ／ ０ ０ ｆ ｍＬ， ｕ 试验菌 立 即倾 注琼 脂 培养基 ， 平行制 备 ２个 平皿 ， 中国药 典 ２ ０ 按 ０ ５年 版培 养 及菌落计数方法测量其菌 落数。空白组 ： 取规定量 供试 液 ，
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5.5.1.2选择和分离培养
取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。
5.5.1.3结果判断
若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
5.5.3.2适用性试验
按“金黄色葡萄球菌检查方法”或“铜绿假单胞菌检查方法”项，取规定量供试液滤过后，于冲洗液中加入1ml相应的试验菌液，滤过。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。
5.5.3.3阴性对照
为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
根据以上特点，本方案中按《中国药典》2015版草案《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》（1105）和《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》（1106）中相关要求，决定采用薄膜过滤法消除稀苯扎溴铵溶液中的抑菌性成分对结果的影响，对供试品中的需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数进行计数，根据草案对其质量标准中规定的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行检查，并对所选用的计数和检查方法进行验证。
5.5.2铜绿假单胞菌检查方法
5.5.2.1供试液制备和增菌培养
取供试品10ml，加入温度不超过45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，稀释制成1﹕10供试液。取10ml供试液，加至90ml稀释液中，混匀，用孔径不大于0.45μm、直径为50mm的滤膜过滤，并用100ml稀释液冲洗滤膜。过滤后，取出滤膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。
5.2.4本方案中所使用的试验菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。制备菌液时应估算菌液中的含菌量，以便于控制加入试验菌的菌量，估算时可采用显微镜直接计数法确定。
5.2.5本方案中需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数），霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
5.4.1.5黑曲霉〔CMCC（F）98 003〕
取黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃、培养5～7天，或直到获得丰富的孢子时，取其新鲜培养物加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，反复吹吸将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的黑曲霉孢子悬液。
5.2微生物限度检查法概述
5.2.1微生物限度检查法系检查非灭菌制剂及其原料药、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查。微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
5.2.2微生物计数试验和控制菌检查试验应在受控洁净环境下（D级）的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
5.2.3本方案中的检验量即一次试验所用的供试品量（ml）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10ml。检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。
5.3.2仪器设备
100级净化工作台；
BSC-1100-L II A型生物安全柜；
BP-II型药物天平；
HHW21型电热恒温水浴箱；
HY35型隔水式电热恒温培养箱；
LRH-250A型生化培养箱；
HTY-302G型微生物限度检验仪；
三洋MLS-3780型高压灭菌锅。
5.4微生物计数方法验证
5.4.1菌种及菌液制备
5.4.1.1金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕
取金黄色葡萄球菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。
5.4.1.2铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕
取铜绿假单胞菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。
4培训
本方案实施前应对参加验证人员进行培训，并做好培训记录确保进行验证的人员均能熟悉、掌握验证过程。
5验证方案
5.1制剂信息
稀苯扎溴铵溶液为苯扎溴铵溶液（5%）稀释于水中配制而成，临床作为手部消毒剂使用，具有强烈的抑菌活性。其质量标准中规定应进行微生物限度检查，每1ml样品中细菌数不得超过100cfu，霉菌和酵母菌数不得超过100cfu，并不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。
5.4.4阴性对照
为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
5.4.5供试品中微生物的回收
按照“菌种及菌液制备”项中所列的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”制备的供试液10ml，加至90ml稀释液中，混匀，用孔径不大于0.45μm、直径为50mm的滤膜过滤，并用100ml稀释液冲洗滤膜。若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天。观察菌落生长情况，点计滤膜上生长的所有菌落数，菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。每株试验菌每种培养基制备1张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数，计算各试验组的平均菌落数。
5.5.2.4结果判断
若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
5.5.3检查方法验证
5.5.3.1菌液制备
取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕或铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为50cfu的菌悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
5.5.3.4结果判断
上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。
5.6偏差处理
（1）试验组取上述制备好的供试液，加入1ml试验菌液，混匀，每张滤膜所滤过的供试液中含菌量约为50cfu。
（2）供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液（温度不超过45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）代替菌液同试验组操作。
（3）菌液对照组取稀释液（温度不超过45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
5.5控制菌检查方法验证
5.5.1金黄色葡萄球菌检查方法
5.5.1.1供试液制备和增菌培养
取供试品10ml，加入温度不超过45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，稀释制成1﹕10供试液。取10ml供试液，加至90ml稀释液中，混匀，用孔径不大于0.45μm、直径为50mm的滤膜过滤，并用100ml稀释液冲洗滤膜。过滤后，取出滤膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。
5.4.2菌液的保存
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
5.4.3供试液制备
取供试品10ml，加入温度不超过45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，稀释制成1﹕10供试液。按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。供试液从制备至加入检验用培养基不得超过1小时。
5.4.6结果判断
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。若各试验菌的回收试验均符合要求，则方法验证通过，可照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数；若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么可采用增加稀释液、培养基体积或加入适宜的中和剂、灭活剂来消除供试品的抑菌活性，并重新进行计数方法适用性验证，根据结果选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。
5.4.1.3枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕
取枯草芽孢杆菌接种于胰酪大豆胨液体培养基上，于30～35℃、培养18～24小时，取其新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成每1ml含菌量约为5000cfu的菌悬液。
5.4.1.4白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕