水产品中孔雀石绿的测定
水产品中孔雀石绿的测定
6.2.8.标准贮备溶液:准确称量孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各10mg，用乙睛分别定容于100mL容量瓶中，配制成100μg/mL的标准贮备液。
6.2.9.混合标准溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为10μg/mL的混合标准溶液。0℃～4℃避光保存。
5.3.仪器和设备
5.3.1.酶标仪：配备450 nm滤光片。
5.3.2.分析天平：感量0.001g，感量0.0001g。
5.3.3.恒温培养箱。
5.3.4.均质器。
5.3.5.旋涡振荡器。
5.3.6.离心机：离心力≥4000g。
5.3.7.氮吹仪
5.3.8.微量单道/多道移液器：10μL～100μL；100μL～1000μL； 50μL～300μL。
5.7.1.检出限
本方法孔雀石绿及其代谢残留物的检出限为0.2μg/kg。
5.7.2.回收率
在样品中添加0.1μg/kg～4μg/kg浓度水平时，回收率为70％～120％。
5.7.3.重复性
本方法的批内变异系数≤10％，批间变异系数≤10％。
5.8.结果表述
当所对应的样品的测定值小于其检出限时，报告为孔雀石绿未检出。当测定值大于检出限时，报告为孔雀石绿检出。
水产品中孔雀石绿和结品紫及其代谢产物的快速测定方法SN/T 1768-2006
水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法GB/T 20361-2006
4.概述
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。
水产品中残留孔雀石绿的毒性与检测方法
I he『esea rch『eviewed水产品中残留孔雀石绿的毒性与检测方法王邦国(靖远县农产品质量安全检验检测管理站730699)摘要：作为一种带有金属光泽绿色结晶体的孔雀石绿,在化学界中被称为四甲基代二氨基三苯甲烷,其在戊醇、乙醇、甲醇以及水中易于溶解,水溶液呈现蓝绿色,抗菌效力在药物染料中较强，可作为驱虫剂或杀菌剂，属于三苯甲烷类染料。
下面本文章将对水产品残留孔雀石绿的研究进展加以分析。
关键词:水产品;残留物质；孔雀石绿；研究进展在养殖过程中，我国曾以孔雀石绿作为清塘杀菌剂，同时，也常将孔雀石绿使用在存放池内和运输过程中，它们在鱼体内可分别代谢为无色结晶紫与无色孔雀石绿，因为其母体化合物与代谢物质存在较大的副作用，极易致突变、致畸、致癌，至此多数国家已经在20世纪90年代将孔雀石绿列为水产养殖禁用药用。
但是现阶段仍有一些渔民在违规使用,主要是因为孔雀石绿价格便宜,抗菌效果较好,所以有效监测孔雀石绿残留物质是至关重要的遥1孔雀石绿的分布与代谢情况进入机体后的孔雀石绿通常会经过生物转化，变成无色孔雀石绿，属于脂溶性的衍生物,极易残留在组织中。
一些业界人士发现，在鱼体内残留的孔雀石绿物质比水体中孔雀石绿的浓度明显要高,主要分布在内脏器官、皮肤、肌肉、肝脏、肾脏以及血浆中,同时体内也会蓄积孔雀石绿，特别是含有较多脂肪的组织中浓度水平更高。
在清除体内的孔雀石绿过程中，除脂肪含量影响与自身解毒能力外，还会受到环境因素的影响，如PH值和温度等。
在体内孔雀石绿的代谢方式有两条:首先，在还原酶的催化作用下,孔雀石绿可降解成无色孔雀石绿;其次，经N-脫甲基作用,在细胞色素催化下,生成次级或初级代谢产物芳香胺。
另外,无色孔雀石绿也有两条代谢方式:首先,基于氧化酶作用下,无色孔雀石绿会被重新氧化成孔雀石绿;其次,无色孔雀石绿经N-脫甲基作用，在催化作用下，酯化后与DNA形成DNA加合物。
2孔雀石绿的毒性与致毒机制据大量研究证实,在水产品中，孔雀石绿对动物的毒性较强,导致鱼皮肤和鳃上皮细胞轻度炎症,扩大肾小管壁细胞的胞核,使肾管腔有轻度扩张，甚至会影响鱼的生长与摄食,减少鱼肠中酶的分泌量。
水产品中孔雀石绿检测的固相萃取方法16316
APP ID NO. : FLM-S170009水产品中孔雀石绿检测的固相萃取方法（SuperClean AL-N）一、实验目的本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，HPLC 法作为分析方法，检测水产品中孔雀石绿含量。
该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
二、实验目标物孔雀石绿(CAS:569-64-2)三、应用范围本方法适用于鲜活水产品中孔雀石绿的检测的HPLC 检测及确证。
四、参考标准《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》五、实验材料NuAnalytical SuperClean Alumina-N 固相萃取柱1000mg/3mL。
六、实验方法1、样品待测溶液制备准确称取鱼肉样品5.0 g 于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈，超声波振荡提取5 m in，涡旋1 min，4000r/min 离心5 min，上清液转移至50 mL 离心管中,残渣按照上述步骤重复提取一次；合并两次提取液，用乙腈定容至25 mL。
2、活化依次用5 mL 乙腈活化3、上样和洗脱在中性氧化铝固相萃取柱上加入5 mL 待净化样品，收集流出液，然后用 4 mL 乙腈洗脱，合并收集流出液。
4、重新溶解流出液45 ℃氮吹至近干，1 mL 乙腈定容，过0.45 μm 滤膜，，供高效液相色谱测定。
5、HPLC 条件色谱柱：SuperLu C18 (250×4.6mm, 5μm)检测器：UV-Vis@618 nm流动相：A-乙腈B-0.05 mol/L 乙酸铵缓冲溶液流速：1.2 mL/min 进样体积: 50 μL洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序如下：时间/min A/% B/%0.0 60 403.00 60 403.10 80 2010.00 80 2010.10 60 40 13.00 60 40七、实验结果1、0.5 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果表 1 0.5 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果回收率（%）名称平均回收率（%）RSD（%）1 2 3孔雀石绿91.0 91.8 87.2 90.0 2.73 2、添加水平为0.5 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图图 1 添加水平为0.5 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图。
水产品有机有害物的检测—孔雀石绿的测定
定量方法
四
内标法：
① 实验过程采用同位素内标法。 ② 内标物为：同位素内标氘代孔雀石绿(D5-MG)、
同位素内标氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)，纯度 大于98%。
检测原理
二
提取原理
试样中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶 紫、隐色结晶紫残留用乙腈提取，中性氧 化铝和阳离子交换固相萃取柱净化。
定量方法
1.液相色谱串联质谱测定 2.内标法定量。
三
1.提取过程：
提取步骤
称取5g样品于50 mL塑料离心管中； 加入20 μL内标标准工作液,加人10 mL乙腈； 匀浆2 min(l0000 r/min)； 超声提取10 min,离心3 min(3000 r/min)； 取上清液再加人10 mL乙腈,重复提取一次；
提取步骤
三
2.净化过程：
活化：5 mL乙腈。 上样：准确吸取5mL过固相萃取柱。 洗脱：用4 mL乙腈淋洗收集。 浓缩：洗脱液氮吹至0.5mL(≤45℃)。 复容：1.0 mL乙腈溶解，再加入1mL 乙酸铵溶液，过0.45 μm滤膜测定。
检测范围
四
种类及项目参数：
① 鱼、虾、蟹、贝、鱼粉、植物源性饲 料、浓缩饲料、配合饲料、饲料添加 剂、精料补充料。
检测原理 提取步骤 检测范围
孔雀石绿 简介
一
孔雀石绿室一种带有金属光泽的绿色结晶体，易 溶于水，水溶液呈蓝绿色。曾经作为杀菌剂，杀虫剂， 消毒剂 广泛应用于养殖业中，预防水产品水霉病、 鳃霉病和寄生虫病等，也用于水产品的运输和存放过 程中消毒并延长鱼类的生存时间，经研究表明孔雀石 绿进入人体或动物体后，代谢产物有高毒性、高残留 具有致畸 致癌 致突变风险严重危害人体或水产品安 全，因此我国已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。
水产品中孔雀石绿快速检测方法
水产品中孔雀石绿快速检测方法
组织检测步骤：
鱼虾等去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取2±0.05g均质物于15ml离心管；加入1瓶去脂试剂，振荡2min，室温4000rpm，离心3min。
倒掉上清液，把肉样弄松散（若要做添加实验，请在此刻加入添加物）；加入1瓶提取剂A，立即摇匀，然后加入1瓶提取剂B，充分振荡混合5min，室温4000rpm，离心5min；取上层有机层4ml到15ml离心管中，加入20ul衍生化试剂，涡旋1min，加入4ml净化剂，颠倒混匀1min，静置1min；取下层（溶液显紫红色）2ml，55℃下使用便携式空气吹干仪吹干；然后加入0.5ml缓冲液剧烈涡旋2min，待检。
检测:从包装中取出微孔，用移液器吸取待检液体80ul至微孔中充分吸打均匀，然后全部滴加至检测卡加样孔（检测卡平放），静置8-15分钟，根据示意图判读结果（见彩图）水样检测步骤：
①用移液器吸取80µl样本液至样品孔中。
②静置5-8分钟，根据示意图判读结果。
结果判定及示意图：
在试纸卡的中央判读区喷有2条线，上面一条为对照线(C线)，下面一条为测试线(T线)。
若样品液中孔雀石绿的浓度小于检测限时，则T线显色比C线强，或显色与C线相近；若样品液中孔雀石绿的浓度大于检测限时，则T线显色比C线浅很多或T线显绿色。
实验设备：
1、孔雀石绿快速检测卡；
2、PRO-12L空气吹干仪;
3、HH-1水浴锅；
4、80-2离心机；
5、均质器；
6、掌上电子天平。
水产品中孔雀石绿的常规检测方法
142实验研究引言我国有着非常丰富的水产资源，在世界上属于水产养殖大国。
水产品作为我国城乡居民摄入动物蛋白的主要来源之一，在居民的生产生活中占据着极其重要的地位。
随着我国科学技术的进步，经济的快速发展，人民生活水平不断提高，对水产品的需求量也不断增长。
在养殖过程中，为降低生产成本，使用含有激素或者发生霉变的饲料，滥用抗生素、激素等渔用药物防治水产动物疾病，导致水产品药物残留超标，严重危害人类健康。
加强水产品中的渔药检测就显得尤为重要，本文阐述及归纳了水产品中孔雀石绿检测的常用方法，为水产品药物残留检测提供重要依据，对保障人类食品安全具有一定的意义。
1.孔雀石绿的常规检测方法1.1前处理方法1.1.1液液萃取液液萃取也称溶剂萃取或抽提，是指利用在溶液系统中两种或多种物质组分溶解度或分配系数不同的原理，使溶质物质从其中一种溶剂中转移到另一溶剂中提取方法。
通过静置过程，将出现分层现象的两种互不相容的物质进行分离的操作，叫做分液。
提取孔雀石绿的过程中常用的萃取溶液是二氯甲烷和无水乙醇。
它的优点是可以在常温条件下进行，操作较为方便，不需要特殊的实验装置和操作技术；缺点是有机溶剂的消耗量较大，挥发性较强的溶剂应尽量在通风橱内操作并做好个人防护工作。
1.1.2固相萃取固相萃取是于20世纪80年代发展起来的一种样品前处理技术，通常与液相色谱技术相结合，主要用于样品前处理的分离、提纯和浓缩过程。
它的原理是通过固相萃取小柱中的固体吸附剂吸附液体中的目标化合物，将样品的基质与干扰物有效的分离，再用洗脱液进行洗脱或者通过加热过程使目标化合物解吸附，最后经过氮吹或者旋蒸，达到浓缩与富集目标化合物的目的。
固相萃取的优点是操作简单，分离时间短，试剂消耗量少，可有效提高被测样品的回收率，对于痕量分析物有较为出色的检测能力；缺点是成本较高，属于一次性使用的实验耗材，同时需要专业人员进行方法开发。
1.1.3分散固相萃取净化技术分散固相萃取净化技术也称为QuEChERS技术，是2003年由美国农业部Anastassiades等人开发，提出之后又经过多次验证和方法改进正式确立。
水产品中孔雀石绿药物残留检测技术研究进展
水产品中孔雀石绿药物残留检测技术研究进展孔雀石绿是一种广泛使用的有机合成染料，在水产品中常用作抗菌剂。
长期食用含有孔雀石绿的水产品可能会对人体健康造成潜在威胁，因为孔雀石绿被认为具有致癌和致畸作用。
为了保障食品安全，对水产品中孔雀石绿的药物残留进行检测已成为当前食品安全监管中的重要课题。
近年来，孔雀石绿药物残留检测技术方面取得了一系列重要的研究进展，本文将对该领域的研究现状进行综述。
一、传统检测方法早期的孔雀石绿检测方法主要依赖于色谱法，包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）和液相色谱法（HPLC）。
这些方法具有高灵敏度和准确性，但是需要昂贵的设备和复杂的操作过程，限制了其在实际监测中的应用。
这些方法还需要长时间的前处理步骤，使得检测周期较长，不适合大规模样品的快速筛查。
二、免疫分析方法近年来，免疫分析方法在孔雀石绿残留检测中得到了广泛应用。
免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫层析法。
这些方法具有操作简单、快速、灵敏度高、专属性强等优点，可以实现大规模样品的快速筛查。
免疫分析方法也存在一些局限性，如易受样品复杂性和干扰物的影响，需要经过繁琐的前处理步骤、易受温度和湿度等环境条件的影响。
五、快速大样品检测技术随着社会经济的发展和人们对食品安全的关注度不断提高，快速大样品检测技术逐渐成为了研究热点。
针对孔雀石绿残留的检测，基于纳米材料和生物传感器技术的快速大样品检测技术也在不断完善中。
通过建立高通量的并行检测系统，可以实现对大批量样品的高效快速筛查，为食品安全监管工作提供了重要的技术支持。
六、发展趋势和挑战随着科学技术的不断进步，孔雀石绿残留检测技术也将不断得到改进和完善。
在未来的研究中，需要重点解决以下几个方面的问题：一是提高检测技术的灵敏度和特异性，以满足对孔雀石绿残留的更加严格的监管要求；二是研发更加便捷、快速的样品前处理技术，以缩短检测周期和降低成本；三是建立完善的质量控制和标准化方法，确保检测结果的准确性和可比性；四是加强与食品安全监管部门和食品生产企业的合作，推动检测技术的产业化应用。
水产品中孔雀石绿残留量的检测与分析
等。 雀石绿在鱼体 内具有高残 留性 ， 且残 留时间长 ， 被人食用
取待检鱼 肉组织样 品均质 ，准确称取 ５ ． ０ ０ ｇ于 ５ ０ ｍ Ｌ有
后 具有致 畸、 致癌作用 。 我国于已将其列入《 食 品动物禁用 的 兽药及 其化合物清单》 中。但因其低廉的价格 、 显著的疗效 ，
使得孔雀石绿并 未退 出渔业市场 。 目前分析水产 品 中孔雀 石绿和 隐性 孔雀石绿 残 留的国 家标准和行业标 准方法 中 ， 从需要 的仪器设备条件 和检测 限 要 求 角 度 ， 采 用 荧 光 检 测 器 的 液 相 色 谱 方 法 Ｇ Ｂ ／ Ｔ ２ ０ ３ ６ １ — ２ ０ ０ ６可在基层检测部 门得 到应用 ，且可满 足对 欧 盟 及 日本 出 口 检 测 限 的 要 求 。 为 此 ，本 论 文 针 对 Ｇ Ｂ ／ Ｔ ２ ０ ３ ６ １ — ２ ０ ０ ６方法在实 际应用过 程中发现 的问题 ，进行
间为 １ ５ ． ２ ａｉ ｒ ｎ 。
４ ． ２ 定量计 算 孔 雀石绿标 准品 ，纯度 ９ ８ ． ５ ％ ，不 确定度 ± Ｐ Ｒ Ｓ小柱 ， Ｖ ａ ｒ ｉ ａ ｎ ， ５ ０ ０ ｍ ｇ ， ３ ｍＬ ；有机滤膜 ，
样 品 中孔 雀石绿 的残 留量 按式 下式计算 ：
１ ． ３ 标准品 １ ． ４ 其 它耗材
加入 １ ０ ｍＬ水 ， 剧烈振荡 ３ ０ ｓ ， ６ ０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ离心 ５ ａｉ ｒ ｎ ， 弃去上层 。
优化研究 ，减少样 品前处理步骤和提高孔雀石绿还原率 ， 从
而达到缩短样品前处 理时间 、 提高回收率 的 目的。
１ 主 要 仪 器 设 备 和试 剂
净化 ： 将Ｐ Ｒ Ｓ 柱安装 在固相萃取装 置上 ， 先用 ５ ｍ Ｌ乙腈 分两
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5.4.6.取3mL上层液(盐酸-乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于60℃下，利用氮气将有机溶剂吹干。
5.4.7.于此玻璃管中加入正己烷1mL ,剧烈震荡将残余物完全溶解(若氮吹后的管内有很多油脂时，可将正己烷加入量改为2mL。)。
5.3.9.水浴锅。
5.3.10.聚四氟乙烯离心管：5mL，50mL，具塞。
5.4.样品处理
5.4.1.将2克已均质之样品放入15mL离心管中，加入0.4%还原剂3mL后立刻震荡1分钟使成肉浆状。
5.4.2.静置30分钟。
5.4.3.再加入6mL 0.002N盐酸-乙酸乙酯，震荡1分钟。
5.4.4.以离心机离心1700×g(约3500rpm)10分钟。
颁布日期：2014年月日
层，待玻璃管冷却至室温后再次以离心机离心1700×g(约3500rpm) 10分钟。用吸管吸去上层液(正己烷)，再吸取下层液(水层)备用
稀释倍数：1
5.5.酶联免疫测定
5.5.1.使用前将试剂盒置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻;
XXX实验室检测中心
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（第A版第0次修改）
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标题：水产品中孔雀石绿的测定
第A版第0次修改
颁布日期：2014年月日
1.目的
使孔雀石绿的测定处于受控状态，保证孔雀石绿检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目检测工作人员的操作规程。
5.4.8.缓缓加入1mL样品稀释液，轻柔混合震荡(vortex) 1分钟。
5.4.9.以离心机离心1700×g(约3500rpm) 10分钟。
5.4.10.若离心后不能确实分层而在两层问出现乳化层时，请置于沸水中隔水加热至上下确实分
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标题：水产品中孔雀石绿的测定
第A版第0次修改
5.3.仪器和设备
5.3.1.酶标仪：配备450 nm滤光片。
5.3.2.分析天平：感量0.001g，感量0.0001g。
5.3.3.恒温培养箱。
5.3.4.均质器。
5.3.5.旋涡振荡器。
5.3.6.离心机：离心力≥4000g。
5.3.7.氮吹仪
5.3.8.微量单道/多道移液器：10μL～100μL；100μL～1000μL； 50μL～300μL。
2.适用范围
本作业指导书规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的酶联免疫测定方法。
本作业指导书适用于鱼、虾以及鱼池或者鱼缸水样中的总的孔雀石绿残留量的检测。
3.引用依据
孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒使用说明书。
水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的快速筛选测定 酶联免疫法DB34/T 1421-2011
5.酶联免疫吸附法
5.1.原理
本孔雀石绿类酶联免疫检验试剂，主要是利用还原剂将样品中的孔雀石绿还原成隐性孔雀石绿后，利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理来进行的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中之隐性孔雀石绿对微孔中之抗体来进行竞争反应。
在整个反应当中，如果样品中之隐性孔雀石绿残留的越多，相对地就会竞争掉越多的抗体，使得结合了与微孔盘上包被的抗原结合抗体的二次抗体相对地就会减少。因此，反应中之酶标记物结合体-底物溶液之呈色就会很淡，甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应。反之，若样品中没有含隐性孔雀石绿，则呈色会比较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。
5.5.2.于适当微孔分别加入100μL隐性孔雀石绿标准液。
5.5.3.在另外的微孔加入100μL已完成前处理之样品溶液。
5.5.4.再于每一微孔另再加入100μL的1倍隐性孔雀石绿抗体。
5.5.5.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。
5.5.6.将微孔中之反应液甩掉，再将300μL的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗3次。
5.5.12.于每一微孔加入底物溶液100μL。
5.5.13.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温卜反应20分钟。
5.5.14.加入反应终止液，每一微孔加入100μL。
5.5.15.酶标仪以单波长450 nm或双波长450 nm/650 nm判读。
5.6.结果判定
5.6.1.定性判定
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含孔雀石绿浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是:0ppb为1.892；0.025ppb为1.501；0.05ppb为1.175；0.1ppb为0.751；0.3ppb为0.421；0.6ppb为0.198。则样品1的浓度范围0.3ppb-0.6ppb;样品2的浓度范围0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍数)
5.2.试剂和材料
5.2.1.实验室用试剂：所用试剂除另有规定外，均为分析纯。水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。
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标题：水产品中孔雀石绿的测定
第A版第0次修改
颁布日期：2014年月日
5.2.2.乙酸乙酯。
5.2.3.正己烷。
5.2.4.12N盐酸溶液
5.2.5.孔雀石绿酶联免疫试剂盒
水产品中孔雀石绿和结品紫及其代谢产物的快速测定方法SN/T 1768-2006
水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法GB/T 20361-2006
4.概述
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。
5.5.7.最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。
5.5.8.于每一微孔加入100μL的1倍二次抗体。
5.5.9.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。
5.5.10.将微孔中之反应液甩掉，再将300μL的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗3次。
5.5.11.最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。