分子生物学分析
分子生物学检验技术
分子生物学检验技术分子生物学检验技术是一种用于研究和分析生物分子如DNA、RNA和蛋白质的技术手段，广泛应用于生命科学研究、医学诊断、药物研发等领域。
它的发展给生物学和医学研究带来了革命性的变化，为人类健康和疾病治疗提供了重要手段。
分子生物学检验技术有多种方法，其中最常见的包括：聚合酶链反应（PCR）、核酸杂交、DNA测序、蛋白质电泳等。
这些技术在生物学研究和医学诊断中发挥着重要作用。
聚合酶链反应（PCR）是一种通过体外扩增DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶酶和引物，通过多次循环反应，在较短的时间内扩增出大量目标DNA片段。
PCR技术广泛应用于基因检测、病原体检测、遗传疾病筛查等领域。
核酸杂交是一种通过互补配对原理来检测目标序列的技术。
它利用标记的探针与待测样品中的目标DNA或RNA序列互相结合，通过检测探针的标记物来确定目标序列的存在与否。
核酸杂交技术广泛应用于基因表达研究、病原体检测、基因定位等领域。
DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
它通过化学或物理方法对DNA 分子进行断裂、扩增和测序，最终确定DNA的碱基序列。
DNA测序技术是基因组学研究的重要工具，也是研究基因突变、病因分析等领域的基础。
蛋白质电泳是一种通过电场作用使蛋白质在凝胶中分离的技术。
它根据蛋白质的大小、电荷和结构差异，将混合样品中的蛋白质分离成不同的条带，从而实现对蛋白质的分析和检测。
蛋白质电泳技术广泛应用于蛋白质组学研究、疾病标志物筛查等领域。
除了上述常见的技术，分子生物学检验技术还包括许多其他方法，如基因芯片技术、原位杂交技术、蛋白质质谱等。
这些技术在不同领域有着特定的应用，为科学研究和医学诊断提供了更多的手段和思路。
分子生物学检验技术的发展不仅推动了科学研究的进展，也在医学诊断和治疗中发挥着重要作用。
例如，在基因检测中，通过分子生物学检验技术可以检测人体携带的致病基因，帮助人们了解自己的遗传状况，预防或早期干预遗传性疾病。
医学分子生物学案例分析题
医学分子生物学案例分析题
一、断裂基因的两种序列之一基因的基本结构外显子是什么？
答：构成断裂基因的两种序列之一，是指初级转录物在剪接时被保留的序列及对应的DNA序列，属于编码序列，在转录区及初级转录物中与内含子交替连接。
内含子：间插序列，是构成断裂基因的两种序列之一，是指促急转路网在剪接时被切除的序列及对应的DNA序列，属于非编码序列。
启动子：是指基因序列中能被RNA素合酵识别、结合，从而形成转录起始复合物并启动转录的DNA序列，通常位于基因（或操纵子）转录区的上游，具有方向性，属于调控序列。
二、病毒基因组的基本特征是什么？
答：1、所含核酸的种类与结构不同2、所含核酸的分子数不同3、基因组核小4、基因组为单倍体并且所含基因为单搏贝5、基因组序列基本上都是编码序列6、基因的连续性不周7、相关基因事联成一个转录单位。
分子生物学实验中的分析软件使用方法介绍
分子生物学实验中的分析软件使用方法介绍随着科技的发展和进步，分子生物学实验的数据量不断增加，对于这些大量的数据进行分析成为了科研工作者不可或缺的一部分。
为了更好地处理和解读这些数据，科研人员们使用各种分析软件来辅助他们的研究工作。
本文将介绍一些常用的分析软件及其使用方法。
一、基因序列分析软件基因序列分析软件是分子生物学实验中最常用的软件之一，它们用于分析DNA或RNA序列以及蛋白质序列。
其中，NCBI Blast是一种非常常用的基因序列比对软件，它可以通过将待比对的序列与已知的序列数据库进行比对，从而确定序列的相关性和相似性。
使用NCBI Blast，我们可以快速找到与我们研究对象相关的序列信息。
二、基因表达分析软件基因表达分析软件用于分析基因在不同组织或条件下的表达水平，以及基因调控网络等。
在这方面，R语言是一种非常强大的工具。
通过使用R语言中的各种包和函数，我们可以对基因表达数据进行聚类分析、差异表达分析、通路富集分析等。
同时，R语言还提供了丰富的数据可视化功能，可以帮助我们更好地展示和解读实验结果。
三、蛋白质结构分析软件蛋白质结构分析软件主要用于预测蛋白质的三维结构以及模拟蛋白质的动力学行为。
其中，Swiss-PdbViewer是一种常用的蛋白质结构可视化软件，它可以帮助我们观察和分析蛋白质的结构特征。
而GROMACS则是一种常用的分子动力学模拟软件，它可以模拟蛋白质在不同环境下的运动轨迹，帮助我们理解蛋白质的功能和机制。
四、基因组学分析软件基因组学分析软件主要用于处理和分析整个基因组的数据，包括基因组序列、基因组注释以及基因组变异等。
在这方面，Ensembl是一种非常常用的基因组分析软件。
它提供了大量的基因组数据和工具，可以帮助我们进行基因组注释、基因组比对以及基因组变异的分析。
五、细胞图像分析软件细胞图像分析软件用于分析和处理细胞图像数据，帮助我们了解细胞的形态和功能。
其中，ImageJ是一种非常流行的细胞图像分析软件，它提供了丰富的图像处理和分析工具，可以帮助我们进行细胞计数、细胞形态分析以及细胞追踪等。
分子生物学总结(一)2024
分子生物学总结（一）引言概述：分子生物学是现代生物学研究的重要分支领域，通过研究生物体内的生物大分子（如核酸、蛋白质等）的结构、功能和相互作用等问题，揭示生物体内生命活动的分子基础。
本文将对分子生物学的核心概念进行总结，包括DNA、RNA、蛋白质、基因调控以及分子遗传学等五个方面。
正文：一、DNA1. DNA的结构：双螺旋结构、碱基配对、磷酸二酯桥、五碱基2. DNA复制：半保留复制、DNA聚合酶、起始子、复制泡3. DNA修复：直接修复、错配修复、碱基切除修复4. DNA重组：同源重组、非同源重组、错配修复5. DNA技术：PCR、DNA测序、基因工程二、RNA1. RNA的功能：信息传递、信息储存、酶催化、调控基因表达2. mRNA的合成：转录、RNA聚合酶、启动子、转录因子3. rRNA和tRNA：核糖体、蛋白质合成、翻译、启动子、终止子4. RNA修饰：剪接、剪切体、甲基化、翻译后修饰5. RNA干扰：siRNA、miRNA、RNA干涉三、蛋白质1. 蛋白质的结构：氨基酸序列、一级、二级、三级结构、蛋白质域2. 蛋白质的合成：翻译、核糖体、启动子、终止子3. 蛋白质的修饰：磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化4. 蛋白质的折叠：分子伴侣、伽马泡沫5. 蛋白质的功能：结构蛋白、酶、激素、抗体四、基因调控1. 转录的调控：启动子、转录因子、转录抑制因子2. 转录后调控：剪接、RNA降解、RNA干涉、翻译调控3. 染色质的结构：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体构象4. 染色质的调控：修饰酶、组蛋白翻译因子、染色质重塑5. 表观遗传调控：组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、DNA甲基化五、分子遗传学1. 遗传信息的传递：基因、等位基因、基因型、表型2. 突变：点突变、重组、演化3. 基因家族：同源基因、家族扩张、功能分化4. 基因表达调控：转录因子、miRNA、表观遗传调控5. 分子进化：基因演化、分子钟、系统发育总结：通过对分子生物学核心概念的总结，我们了解到DNA、RNA和蛋白质在生物体内起着重要的功能和调控作用，而基因调控和分子遗传学则是揭示生物体内分子基础和发展演化的重要研究领域。
分子生物学实验常见问题分析及对策-20
分子生物学实验常见问题分析及对策-20质粒的提取常见问题与对策Q1: 提质粒没有明显的沉淀，能说明是没有提出来吗？跑完电泳还是没有条带能证明质粒没提出来吗？A: 提质粒的时候没有明显的沉淀，也有可能是由于你加的乙醇量少或异丙醇量不足或质量有问题。
或者质粒太少了难以用肉眼看出。
跑完电泳还是没有条带也有可能是跑胶时配置胶出问题，或染色剂不够，或者你加的质粒量少。
要具体情况再分析Q2:质粒条带很暗而且通常只有一条带是什么问题？A:没有用试剂盒提取的话可能考虑技术问题。
如果常做质粒的提取，且用的是试剂盒，还出现这种情况，就要从质粒本身着手考虑了：首先做个PCR鉴定一下，确保有质粒的情况下，很可能质粒是低拷贝的，如此就要用大量的细菌来提取质粒。
一般的用可以用水煮法提(1ml菌液离心,沉淀加50μl DEPC 水,100度水煮3-4分钟,离心取上清夜,含有大量的质粒)用1-2μl作为模板跑PCR效果很好。
Q3: 用分光光度计测得的质粒浓度很高，但是跑出来的电泳却看不到条带，这是什么原因？A: 三种可能：1）可能EB有问题，应同时检查同一块胶上其它样品是否有条带。
2）计算OD260/280比例，有可能为蛋白污染所致。
3）稀释后上样的浓度过低。
Q4: 提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？A: 质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。
经常会出现。
2）两条带，超螺旋/闭环/开环任意两种。
3）一条带，超螺旋。
至于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了。
1）进行分子克隆的操作，构建载体。
这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。
所以在这种情况下，没必要评比谁好谁不好。
2）进行细胞转染。
因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是： 3）、2）、1）。
Q5: 如何降低质粒变性超螺旋的含量？A: 理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。
分子生物学的实验技术分析
分子生物学的实验技术分析分子生物学是生物学中最具前沿性、发展性、实践性的学科领域之一，它研究的是生物体中的基本单位——分子，对分子的结构和功能进行研究，通过对分子水平上性状和规律的探寻，为生物体其他生成层面的实践和发现提供了必要的基础。
而分子生物学的实验技术的掌握，则是进一步深入研究分子生物学的基石。
本文将探讨分子生物学的一些实验技术及其应用。
一、PCR技术的应用PCR技术，全称为聚合酶链反应，是分子生物学中最重要、最常用的实验技术之一，其主要作用是将分离出的核酸片段在体外扩增并复制为大量片段以方便下一步操作。
PCR技术的应用包括但不限于：遗传病联合分析、DNA指纹、基因克隆等方面。
1. 遗传病联合分析遗传病联合分析是指对遗传病发生进行家系及关系分析，通过PCR技术分析目标基因片段，结合血统分析等技术，最终确定研究对象的基因型，可以帮助人们早期发现潜在遗传疾病的风险，从而采取有针对性的应对措施。
2. DNA指纹DNA指纹是指利用PCR技术对DNA片段进行扩增，进而内含核苷酸重复序列的某些区域进行分析，可以将DNA作为基础信息进行犯罪检验、亲权鉴定、遗传病诊断等研究方向。
3. 基因克隆基因克隆是指将目标基因从其主体DNA中分离出来，通过PCR技术进行繁殖和扩增，使其得以产生大量拷贝，从而实现对顺式调控的探究、蛋白质表达等研究。
二、蛋白质组学技术的应用蛋白质组学技术是指通过大规模的蛋白质分离、纯化、鉴定等技术，来研究蛋白质的结构、功能、调节等特性。
其主要应用包括但不限于：药物开发、疾病诊断、标本分析等方面。
1. 药物开发蛋白质组学技术可以用来寻找指向性药物的底物，即通过蛋白质组学技术来寻找作用于特定蛋白质的分子作用物，为新药开发提供更好的渠道和平台。
2. 疾病诊断蛋白质组学技术可以对病人的血液、组织、脑脊液等进行蛋白质分析，准确鉴定病因并且发现血蛋白质标志物，用于早期诊断、疾病分类和疗效评估。
3. 标本分析蛋白质组学技术可以对诸如地质样品、生物样品、食品样品等各种常见物质进行蛋白质分析，以识别并鉴定其中存在、是否产生污染的残留物质、化合物等。
分子生物学分析3篇
分子生物学分析第一篇：PCR技术PCR，全称为聚合酶链反应（polymerase chain reaction），是分子生物学领域最为常用的一种技术。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火、延伸。
它能够在较短的时间内扩增DNA片段，是分子生物学重要的基础技术之一。
PCR的原理是在DNA双链的末端加上引物（primer），用DNA聚合酶（polymerase）在引物的指导下进行扩增。
具体来说，PCR的步骤如下：首先将DNA样本加入PCR反应体系中，然后加入两种适当浓度的引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液。
接着进行多次循环加热（变性）、退火（引物结合）和延伸（聚合）。
PCR技术在基因组测序、基因工程、分子诊断等领域得到广泛应用。
例如，在基因诊断中，可以通过PCR扩增DNA片段，将DNA序列中的突变基因分析出来，从而达到对致病基因的检测和诊断。
需要注意的是，PCR技术能够扩增任何目标DNA片段，包括病原体、动植物、人类等。
因此，在使用和处理PCR反应体系时需要特别小心，避免交叉污染。
第二篇：Gel电泳分析Gel电泳是一种分离生物大分子的技术，主要应用于DNA、RNA、蛋白质等分子的分离和检测。
其基本原理是利用凝胶的孔隙大小和电荷作用，将带电分子作用下垂直电场向电极运动，以实现分子的分离和检测。
Gel电泳技术有不同类型，如聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）、蛋白质电泳等。
其中，琼脂糖凝胶电泳在DNA、RNA分析中应用广泛。
在DNA分析中，Gel电泳是确定PCR扩增产物的常用技术。
其过程是将PCR产物样品加入琼脂糖凝胶孔中，加上电场使DNA分子沿电场方向运行，电泳后形成DNA条带。
这些条带是根据DNA分子的长度确定的，通常与DNA的分子量成正比。
与PCR扩增产物相比，琼脂糖凝胶电泳也可用于检测来源于各种天然DNA样本。
通过运行DNA分子，可以了解DNA分子大小和特定区域的序列。
分子生物学分析
2.6分子生物学分析目前较常采用的微生物学分析方法有两种，一种是使用传统的微生物培养技术（culture）将微生物富集、分离，然后通过一般的生物化学性状或表现型来分析的间接途径。
然而使用传统的微生物培养技术存在许多困难，尤其是环境中大多数微生物生长缓慢，例如本论文研究中针对的anammox菌的培养富集时间均在2年以上，同时对培养条件要求极为苛刻，客观上阻碍了采用这种方法对其的研究。
第二种途径依靠聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术及应用进化和功能基因探针直接从环境样品中检测和分析目标微生物，不需富集培养。
分子生物技术有简洁、快速、精确等特点，广泛应用于微生物生态学研究中。
尤其是目标微生物主要功能基因的DNA序列数据库和PCR技术结合在一起，使许多分子生态学手段可以直接应用于环境样品的研究中，，推动了环境中微生物生态学研究。
本论文研究中采用了第二种途径中的定量PCR技术手段。
下面将根据实验中的具体操作进行叙述。
2.6.1DAN提取本文研究中主要采用的是试剂盒提取方法。
DAN提取盒使用美国MP公司的土壤DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil，MP Biomedicals, Santa Ana, USA）。
提取方法依据说明书进行微小变动，即向污泥中先加入Sodium Phosphate Buffer（磷酸钠缓冲液），再将其移至Lysing Matrix E管中，具体操作方法如下：（1）向 1.5ml取回污泥离心（10000rpm×10分钟）的湿污泥加入978 μl Sodium Phosphate Buffer（磷酸钠缓冲液），然后将其移到Lysing Matrix E管中（尽可能将其全部加入），然后加入122 μl MT Buffer（MT缓冲液）。
注：因为FastPrep®仪器的剧烈运动，在Lysing Matrix E管内会形成巨大的压力，样品和基质的总体积不能超过管体积的7/8；留一些空间也会提高混匀效果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2.6分子生物学分析目前较常采用的微生物学分析方法有两种，一种是使用传统的微生物培养技术（culture）将微生物富集、分离，然后通过一般的生物化学性状或表现型来分析的间接途径。
然而使用传统的微生物培养技术存在许多困难，尤其是环境中大多数微生物生长缓慢，例如本论文研究中针对的anammox菌的培养富集时间均在2年以上，同时对培养条件要求极为苛刻，客观上阻碍了采用这种方法对其的研究。
第二种途径依靠聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术及应用进化和功能基因探针直接从环境样品中检测和分析目标微生物，不需富集培养。
分子生物技术有简洁、快速、精确等特点，广泛应用于微生物生态学研究中。
尤其是目标微生物主要功能基因的DNA序列数据库和PCR技术结合在一起，使许多分子生态学手段可以直接应用于环境样品的研究中，，推动了环境中微生物生态学研究。
本论文研究中采用了第二种途径中的定量PCR技术手段。
下面将根据实验中的具体操作进行叙述。
2.6.1DAN提取本文研究中主要采用的是试剂盒提取方法。
DAN提取盒使用美国MP公司的土壤DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil，MP Biomedicals, Santa Ana, USA）。
提取方法依据说明书进行微小变动，即向污泥中先加入Sodium Phosphate Buffer（磷酸钠缓冲液），再将其移至Lysing Matrix E管中，具体操作方法如下：（1）向 1.5ml取回污泥离心（10000rpm×10分钟）的湿污泥加入978 μl Sodium Phosphate Buffer（磷酸钠缓冲液），然后将其移到Lysing Matrix E管中（尽可能将其全部加入），然后加入122 μl MT Buffer（MT缓冲液）。
注：因为FastPrep®仪器的剧烈运动，在Lysing Matrix E管内会形成巨大的压力，样品和基质的总体积不能超过管体积的7/8；留一些空间也会提高混匀效果。
（2）在FastPrep®中处理上述离心管，速度6.0，40秒。
（3）Lysing Matrix E管离心14000g×15分钟。
（4）将上清液转移到一个新的2ml离心管（自备）中，加入250μl PPS，并用手上下颠倒10次进行混合。
（5）离心14000g×10分钟，至形成白色状沉淀物，将上清液转移到一个新的10ml离心管（自备），并加入1ml Binding Matrix Suspension（在用之前重悬Binding Matrix Suspension，一定要摇匀到瓶底看不见沉淀为止，加5个摇一次以防止放置时间而沉淀）。
（6）用手上下颠倒2分钟，使DNA附着到基质上，把离心管放到架子上静置3分钟。
（7）小心去除500μl上清，避免扰动沉淀的Binding Matrix，重悬剩余的上清；转移大约600μl的混合液到一个SPINTM Filter中，离心14000g×2分钟；将SPIN TM Filter下面catch tube中的液体倒掉；重复上述过程（重悬→移液→Filter→离心→弃catch tube中的液体）直到剩余混合液全部转移离心完（8）加入500μl SEWS-M到SPINTM Filter中，利用移液枪的挤压重悬。
（9）离心14000g×2分钟，将下面catch tube中的液体轻轻地倒掉，重复以上操作一遍。
（10）减掉SPINTM Filter盖子，不加任何东西离心14000g×2分钟，去除基质中的SEWS-M。
（11）将SPINTM Filter放到一个新的Catch Tube中，在室温下风干SPINTM Filter 15分钟。
（12）加入80uL DES，用手轻弹侧壁至液体与粉末充分混合，使滤膜上的沉淀物重悬，从而使DNA有效洗提；55℃加热5min，离心14000g×2分钟，使DNA转移到Catch Tube中。
可重复此步，已达到最大量的提取DNA的目的。
（13）使用DNA测定仪（NANO DROP 1000）测定样品中DNA的浓度（ng/uL）和纯度（A260/A280和A260/A230）。
2.6.2PCR扩增（1）PCR简介PCR是一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，又称无细胞的分子克隆法。
它利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行DNA体外合成反应。
由于PCR循环可进行一定次数（通常为25-35个循环），所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。
PCR作为一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，具有特异性强、灵敏度高和简便快速的特点，在环境微生物学领域得到了广泛的应用。
PCR反应由变性、退火、延伸三个基本反应步骤组成：①模板DNA变性：模板DNA经加热至94℃左右后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 会发生解离，成为单链，这样就可以与引物结合；②模板DNA与引物的退火（复性）：在变性过程中模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至相应的退火温度左右，引物就会与模板DNA单链的互补序列进行配对和结合；③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下DNA模板-引物结合物以dNTP为反应原料，模板为靶序列，按照碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
（2）PCR扩增仪器：9700型PCR扩增仪(ABI，USA)本论文主要研究不同来源种泥对富集厌氧氨氧化菌富集的影响。
在对种泥做初步筛选时，对于Anammox菌16S rRNA基因的扩增采取巢式PCR的方式，第一步扩增引物为pla46f-630r，第二步为Anammox菌特异引物Amx368f –Amx820r，预计获得片段长度为483bp左右的扩增片段[1]。
Anammox菌[2]和全细菌PCR扩增的引物和反应条件如表2.所示，反应体系如表2.所示。
Anammox菌第二步扩增产物长度和全细菌扩增产物长度分别为483 bp和1465 bp，扩增结束后所有PCR 产物均通过1 %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
表Anammox菌和全细菌PCR扩增的引物和反应条件2.6.3定量PCR（1）定量PCR简介定量PCR（Quantitative real-time PCR ，qPCR)）技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
现在通用的qPCR检测系统主要有两类：非特异的DNA嵌入染料（如SYBR green I）和以杂交形式进行的单链检测系统，有水解探针（如TaqMan）、杂交探针（如Lightcycler）等。
它们分别利用PCR延伸和退火阶段产生荧光产物，PCR扩增的每个循环荧光信号都会放大。
仪器根据这些荧光物质的特异的波长检测荧光量，并使用分析软件计算出初始模板量。
qPCR 技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。
本研究采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行qPCR测试。
PCR反应生成双链DNA，SYBR® Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA 片段的融解温度。
该法的可对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。
（2）qPCR仪器：ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)对Anammox菌的定量是针对功能基因进行的。
联氨合成酶（Hydrazine synthase gene，hzs B）Anammox菌特有的酶，它可催化合成厌氧氨氧化过程中的重要中间产物联氨（N2H4）。
Anammox菌[2]和全细菌qPCR [21][22]的引物和反应条件如表2.所示，反应体系如表2.所示。
Anammox菌和全细菌扩增产物长度分别为192 bp和385 bp。
表Anammox菌和全细菌qPCR的引物和反应条件（3）标准曲线和质粒浓度计算准备标准曲线，通过克隆获得的标准质粒进行10 倍梯度稀释，共做8个浓度（即8 个点，如果后面结果中有差异太大的点，可以去掉1 到2 个，以保证标线的线性）。
样品的稀释：本实验中采取5 uL 样品加到45 uL 灭菌超纯水中稀释的方法进行梯度稀释。
为了保证定量结果的准确性，样品需要混合均匀，然后用离心机离心一下再进行操作。
每个标准点又做3 个平行样。
质粒的制备：首先对目标基因进行PCR，产物进行克隆（克隆技术见下一部分的讲述），测序确认是目标基因，然后用质粒提取试剂盒（如天根质粒提取试剂盒、Fermentas 质粒提取试剂盒等）将菌液提取质粒，用NanoDrop 测定DNA 浓度，作为标准质粒。
标准质粒可以用PCR 离心管分装-20℃保存，避免反复冻融。
如果样品已经稀释好，但是一天测不完多个定量（比如需要同时测试一个样品中的全细菌和anammox），可以将稀释的样品放入4℃即可。
因为如果放入-20℃，可能会由于第二天冻融而导致DNA降解断裂。
标准质粒的浓度计算：拷贝数浓度(copies/μL) = DNA 质量浓度(ng/μL) / DNA 分子量(g/mol)×6.02×1023×10-9DNA分子量= 660×片段长度(bp) + 质粒分子量(见质粒说明书)质粒分子量=质粒载体长度×660660为一对碱基的分子量，1Dolton=1g/mol本试验所用两种DNA长度如表2.所示。
（4）待测样品的处理预先提取待测样品DNA，同样用NanoDrop 测定其浓度，-20℃保存。
做qPCR 时，将待测样品DNA 做适度稀释，也可进行梯度稀释，稀释度需要做过几次才好把握，目的是尽量将DNA 浓度稀释到标线范围之内。
同样，每个样品需要做3 个平行样。
（5）质量控制1）标准曲线至少5 个点，检测限尽量低；2）相关系数R2 > 0.99；3）扩增效率通过斜率来计算，Efficiency = (10^1/slope-1)×100 (%)，要求效率在90%-110%之间；4）检查阴性对照的扩增曲线Ct 值，如果阴性对照不大于35 则代表样品被污则代表样品被污染；5）产物特异性：a.通过熔解曲线得到的熔解温度要单一，并与标准质粒的熔解温度接近，不超过0.3 ℃的差异。