分子生物学第二次讨论课
IPG 胶条支架
IPG 胶条 定位
泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入 IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：
待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 样品的复杂度
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能 完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
当溴酚蓝跑至分离胶末端时，停止电泳。
完成电泳后，凝胶浸泡于转膜缓冲液中，轻摇20min
除去电泳缓冲液中的盐与去污剂
转膜
按“黑板- 纤维垫子- 滤纸- 胶 - 膜 - 滤纸- 纤维板子- 白板” 配好 在膜的反面标字，标上点样孔和分离胶的位置 然后，将转膜夹放入转膜槽中，电泳
强碱性蛋白(如核糖体)的处理
• 预处理富集 • 特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦
极端分子量蛋白的处理
• 小于8kD 对流混合，产生绒毛状或模糊的带 • 大于200kD的蛋白，变性为多肽
固定pH 梯度(IPG)示意图
丙烯酰胺单体 酸缓冲基团：COOR 碱缓冲基团： NH3+
使被分离的 蛋白质与SDS 完整结合
SDS
IPG 胶条
标记纸片
向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖
SDS-PAGE
SDS-PAGE
SDS-PAGE
染色方法
胶体考马斯亮蓝染色
灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍 可实现PAGE的无背景染色 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果
胺基黑染色
转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色
易碎的细胞 坚硬的组织 植物细胞 真菌
温和
方法
剧烈
温和破碎法
渗透压冲击(培养的细胞)
低渗液中的悬浮细胞
反复冻融法(细菌)
液氮冷冻
去污剂降解(酵母、霉菌)
降解缓冲液(含尿素和去污剂) SDS(应在IEF前去除)
酶降解(植物、细菌、真菌)
溶菌酶(细菌) 纤维素酶，果胶酶(植物) 溶壁酶(酵母)
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
第一向：等点聚 焦 1. 放臵电极垫 (?)
2. 200 V 3. 500 V 维持 维持 1.5h
支架盖
电极 垫
1.5h 1500vh
IPG 胶条 电极
4. 1000 V 梯度上升 5. 8000 V 梯度上升 (?) 36000vh
CH2 = CH-C-NH-R O
聚丙烯酰胺凝胶
宽pH梯度及窄pH梯度
宽pH梯度用于：
全部蛋白 (确定感兴趣蛋白的 大致位臵)
窄pH梯度用于：
提高分辨率
增加载样能力以检测、分析 更多蛋白
IPG 胶的重泡涨及上样
2-DE 样品 重泡涨溶液
重泡涨溶液：
8M 2% 2% 0.28% 微量 尿素 NP-40 或 CHAPS IPG缓冲液 (两亲性电解液) DTT 溴酚蓝
IPG 胶条的平衡
平衡液
6 M 尿素和30% 甘油 减少电内渗
第一步平衡
加DTT 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态
第二步平衡
加碘乙酰胺 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化
第二向: SDS-PAGE
• SDS 平衡 • SDS-PAGE
SDS 平衡液
50 mM 6M 30% 2% 微量 Tris-HCl 尿素 丙三醇 SDS 溴酚蓝
5% 乙酸 25% 甲醇
染色方法
负染
主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用
能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率
速度快（5~15min）且能保持蛋白质的生物活性 不能用于膜上染色
适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析
胶体扩散染料
主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 灵敏度与PAGE胶内的银染类似 不用于胶内染色
电泳 接好正负极开始电泳。30ma恒流电泳。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚 合而成的三维网状孔结构。 调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝 胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层 凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸 钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子 表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基 乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全 伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的 蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电 荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋 白质间所带电荷上的差异
Western blot 、蛋白 质双向电泳的原理、方法 及在医学中的应用
Western免疫印迹技术
准备工作 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
基本原理
蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下解离而带电 荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本 身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于 蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极 移动
两性电解质
pH 9 聚丙烯酰胺 pH 3 +
样品
-
等点聚焦 (第一向)
第二向
分子量
SDS-PAGE
pH 梯度(pI)
双向电泳具体步骤
样品制备
缓冲液的配制
IPG条重泡涨及上样
第一向：IEF
IPG条平衡
平衡缓冲液Ⅰ(还原) 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)
第二向：SDS-PAGE
胶条染色
成像及图像分析
为什么要进行样品制备 ？
目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质 点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。
待研究样本 ( 如临床样本 ) 常是各种细胞和组织混 杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。
样品制备原则
1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少
尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 白）。 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解 等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检 测性。 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。
作用
去除杂质 浓缩样品 抑制蛋白酶活性
对于疏水性特别强的蛋白 如膜蛋白
硫脲 SDS 新型两性表面活性剂 (如磺基甜 菜碱)
关键-可溶性
获得可以重新溶解的蛋白
常用方法
硫酸铵沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇/苯酚抽提
样品中杂质的去除
– 尽量不丢失蛋白 – 减少 – –
脂质
使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI 丙酮沉淀
多糖
阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH
– –
盐
使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮
离子去污剂
如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 丙酮沉淀；将含 SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如 CHAPS ， Triton X100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25%
2 最大限度减少样品的损失
低温保存样品(一般需低于-86℃) 尽量缩短处理时间 除盐，省略不必要的过程 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。
样品制备流程及注意事项
预处理
(清洗等)
破碎
富集
按溶解度分级
溶解
除杂
样品的破碎
原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解
样品的来源
去除原则
– – – –
杂质的主要种类
DNA/RNA 脂质 多糖盐 离子去污剂
– 其他固体杂质
DNA/RNA的去除
样品中含核酸的不利影响
– 能被银染色法染色 – 在凝胶酸性部分产生水平条纹
– 当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀
去除方法
蛋白沉淀法 DNase/RNase处理 超声(机械破坏)、超高速离心 DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)
固体杂质
阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 过滤
样品的溶解
2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一
溶解的目标
样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个
多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 2-DE中出 现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）
溶解方法必须允许可能干扰 2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物
对膜进行封闭 降低抗体与膜的非特异性结合
膜泡于封闭液中，4摄氏度摇晃过夜
抗原抗体杂交
一抗稀释后加于膜上，室温 1 到2 小时。洗去一抗后，加入生物素 连接的二抗，室温1小时。洗去二抗后，加Avidin-HRP反应。 洗去游离HRP后，立即用ECL化学发光剂进行检测。 HRP在碱性条件下催化发光胺氧化，放出光子 方法之一
应用
检测结核抗体 检测过敏原
蛋白质双向电泳技术
分子生物学第二次课
DNA REPLICATION, MUTATION AND REPAIRWang Di （王迪）Ph.D2010-09-08Institute of Immunology, diwang@DNA to RNA to Protein Understanding the central dogma of BiologyDrawn by Ebbe Sloth Andersen.The central dogma states that once “information”has passed into protein it cannot get out again. The transfer of information from nucleic acid to nucleic acid, or from nucleic to protein, may be possible, but transfer from protein to protein, or from protein to nucleic acid, is impossible. Information means here the precise determination of sequence, either of bases in the nucleic acid or of amino acid residues in the protein.Francis Crick, 1958DNARNAProteinJames Watson, Francis Crick , Howard Temin, David BaltimoreWhat is DNA?üDNA is deoxyribonucleic acidüIt is a polymer of nucleotidesüIt encodes the information necessary to build a cell üIt allows the storage and replication and execution of cellular information4 types of baseADENINE–THYMINECYTOSINE-GUANINEA T G C DNA contains A, G, C, T, while RNA contains A, G, C, U.DNA StructureNucleic acids arenamed for the typeof sugar: DNA has2'-deoxyribose,whereas RNA hasribose. Thedifference is thatthe sugar in RNAhas an OH groupat the 2' position ofthe pentose ring.DNA: (deoxyribonucleic acid)üdouble helix;übase pairing; A, T, C, Güminor groove and major groove;üsupercoling, open circular and line;üstoring information;üReplicate faithful following base-pairing rules;üMutations: sometime good? sometime bad?DNA is the Genetic Material1.Replicate faithfully2.Have the coding capacity to generate proteins and other products for all cellular functions“A genetic material must carry out two jobs: duplicate itself and control the development of the rest of the cell in a specific way.”Francis CrickDNA ReplicationüThree models for the replication of DNA üreplication origin 、direction & speed üProteins of DNA ReplicationüDNA synthesis is semidiscontinuousüThe process of DNA replication of E.coli ücircular DNA replicationülinear DNA replicationThree models for the replication of DNAThe hypothesis of semi-conservative replication proposed by Watson and Crick in 1953Meselson-Stahl ExperimentMeselson & Stahl, 1958Replication origin, Direction & Speed Replicon:The unit of DNA in which an individual act of replication occurs is called the replicon. Replication fork: The point at which separation of the strands and synthesis of new DNA takes place.Each replicon "fires" once and only once in each cell cycle.ProkaryoticSingle replicon,single termination,bidirection, tworeplication forksEukaryoticMany replicons andtermination sites,bidirection, manyreplication forks,adjacent replicationbubbles fuse whenthey meet each other.Electron Microscopy of replicating DNA reveals replicating bubbles.Speed of ReplicationProteins of DNA Replication1. DNA Helicases –These proteins bind to thedouble stranded DNA andstimulate the separation ofthe two strands.2. DNA Topoisomerase –This enzyme catalyzes the formation of negative supercoils that is thought to aid with the unwinding process. (Type I and Type II)2. DNA Topoisomerase –DNA topoisomerase IIDNA topoisomerase II3. DNA single-stranded binding proteins （SSB）Stabilizing the single-stranded structure that is generated by the action of the helicases.Replication is 100 times faster when these proteins are attached to the single-stranded DNA.SSB: Single Strand DNA-binding Proteins, also called helix destabilizing proteinsSSB Proteins4. Primerase: (DDRP, different from RNA pol) Synthesis a 5-10 nt RNA primer using DNA template for the elongation of lagging strand DNA replication.5. DNA LigaseThe final replication product does not have any nicks because DNA ligase forms a covalent phosphodiester linkage between 3'-hydroxyl and 5'-phosphate groups.DNA Primer synthesis On Lagging strandDNA Ligase5. DNA Polymerase of E.coliArthur Kornberg:He was the first to identify theenzyme catalyzing the synthesis ofDNA, polymerase I. In recognitionof their work elucidating the basicmechanisms of DNA replication,they were awarded the Nobel Prizein 1959.5' to 3' polymerase 3' to 5' exonuclease 5' to 3' exonucleaseDNA Polymerase IThe chain can be cleaved into two parts by proteolytic treatment.The larger cleavage product (68 kD) is called the Klenow fragment .It contains the polymerase and the 3 –5 exonuclease activities.The small fragment (35 kD) possesses a 5 –3 exonucleolytic activity, which excises small groups of nucleotides, up to ~10 bases at a time.DNA Polymerase I Nick TranslationDNA Polymerase III (900KD)ü900 kDü10 proteinsüdifferent types of subcomplexkDa Gene SubassemblySubunitα 130 dnaE | 5'-3'polymerase| POL III COREε 27.5 dnaQ(mutD)θ 10 | 3'-5'exonucleaseτ 71 dnaXγ 47.5 dnaX |δ 35 | ATP dependent δ' 33 | γ COMPLEX clamploaderχ 15 |ψ 12 |β 40.6 dnaN βCLAMP processivityfactorDNA POLYMERASE IIIüTwo copies of the catalytic core. αsubunit (the DNA polymerase activity), εsubunit (3 –5 proofreading exonuclease), and θsubunit (stimulates exonuclease).üTwo copies of the dimerizing subunit, τ, which link the two catalytic cores together.ütwo copies of the clamp, which is responsible for holding catalytic cores on to their template strands.DNA PolymeraseNucleotide polymerizing enzyme, first discovered in 1957DNA Polymerase III Mechanism for PrecisionStructures of DNA polymerase during polymerizing and editing E: exonucleolytic; P: polymerizationDNA replication is semi-discontinuousOkazaki FragmentsSynthesis ofOkazakifragmentsrequires priming,extension,removal of RNA,gap filling, andnick ligation.Structure of the Moving ComplexSummary ICharacters of Circular DNA Replicationθreplication(bacteria)DNA replication with two forks。
分子生物学课程教学大纲
《分子生物学》课程教学大纲课程编码：03220080课程名称：分子生物学( Molecular Biology )学分：3学分总学时：60学时理论学时：36学时实验学时：24学时适用专业：生物技术专业先修课程：生物化学、微生物学使用教材及主要参考书：1. 使用教材：《基础分子生物学》，郑用琏编著，高等教育出版社，2012年；《分子生物学及基因工程实验教程》，刘箭编著，科学出版社，2012年；2. 主要参考书：《现代分子生物学》（第二版），朱玉贤、李毅编著，高等教育出版社，2007 年；《分子生物学》，郜金荣，叶林柏编著，武汉大学出版社，2007年；《分子生物学简明教程》，刘永明主编，化学工业出版社，2006年；《精要速览系列：分子生物学》（第3版）（中译版），特纳（Phil Turner）著，科学出版社，2010年；一、课程在培养方案中的地位、目的和任务分子生物学(molecular biology)是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学。
分子生物学的理论和方法已在生命科学、医学和工农业生产等各个领域里得到广泛应用。
通过本课程的学习应使学生了解生命科学发展的方向与前沿，了解分子生物学在生命科学等领域的应用与前景。
使学生掌握分子生物学的概念、研究内容与特点，掌握生命活动中重要的生物大分子的结构与功能、遗传信息的表达及其调节控制等内容。
二、课程基本要求(一) 基本理论和基本知识1. 掌握分子生物学的概念、研究内容与特点；2. 了解基因概念的演变，掌握基因的概念，及核算分子的精细结构与功能；3. 掌握原核生物与真核生物基因组的结构及特点；4. 掌握DNA 复制的一般特点及过程，掌握基因突变和遗传重组的分子机制；5. 理解转录的基本过程、机制；掌握真核RNA 的转录后加工；6. 掌握蛋白质合成的生物学机制；7. 掌握原核基因表达调控模式和真核基因表达调控的一般规律，深刻理解基因表达的精细性和复杂性及高度可调控性；(二) 基本技能1. 掌握质粒DNA、RNA的提取和检测方法；2. 掌握PCR方法，及感受态制备和转化筛选方法；3. 了解生命科学发展的方向与前沿，及其在有关领域的应用与前景。
朱玉贤现代分子生物学第二章思考题参考答案
染色体具备哪些作为遗传物质的特征？遗传信息的载体。
染色体携带着大量的DNA信息，包括基因、调控序列以及非编码区域等，这些信息决定了细胞的生命活动和遗传特征。
稳定性和可传递性。
染色体的结构稳定，能够维持遗传信息的准确性，并通过有丝分裂和减数分裂精确地传递给下一代。
基因组的组织者。
染色体将基因组按照一定的序列和结构有序地组织和紧密地装配在一起。
遗传多样性的来源。
基因在染色体上的排列组合可以产生多种遗传型，这种变异与染色体的重组和交叉有关。
反应环境变化的灵活性。
染色体结构在环境压力和生物进化过程中发生变化，促进物种适应新的生存环境和获得新的生存优势。
配对性和杂交性。
染色体是由来自双亲的两条染色体结合而成的，具有配对性和杂合性，这对基因型和表型有很大影响。
重组。
染色体上的基因会在有丝分裂和减数分裂过程中进行重组和交叉，从而产生新的基因组合和遗传多样性。
随机分离。
染色体的分离及其内容的随机分配，决定了基因组在不同代之间的巨大差异，这是基因多样性和遗传进化的基础。
转座子。
染色体上除了基因和调控序列外，还存在着转座子，它是一类可跳跃的基因或DNA片段，具有自主复制和插入的特性，能够影响染色体结构和功能。
以上是染色体作为遗传物质的常见特征，这些特征决定了染色体在遗传学和进化生物学中的重要地位和作用。
简述真核细胞内核小体的结构特点。
真核细胞内核小体（nucleolus）是一个细胞器，它位于细胞核内，由RNA和蛋白质组成。
它是真核细胞核仁形成和转录翻译的场所，是细胞中染色体转录和合成核糖体的重要场所。
以下是真核细胞内核小体的结构特点：明显的结构特征。
内核小体在光学显微镜下呈圆形或椭圆形的结构，其大小约为1-2μm，数目根据细胞的类型和生长状态而有所变化。
由RNA和蛋白质复合物组成。
内核小体由三种不同的RNA和多种蛋白质复合物组成，主要包括核糖体RNA（rRNA）、核糖体蛋白（r-protein）和未经翻译的mRNA和snRNA等。
《分子生物学》课程教学大纲
《分子生物学》课程教学大纲《分子生物学》课程教学大纲课程编码：03220080课程名称：分子生物学( Molecular Biology )学分：3学分总学时：60学时理论学时：36学时实验学时：24学时适用专业：生物技术专业先修课程：生物化学、微生物学使用教材及主要参考书：1. 使用教材：《基础分子生物学》，郑用琏编著，高等教育出版社，2012年；《分子生物学及基因工程实验教程》，刘箭编著，科学出版社，2012年；2. 主要参考书：《现代分子生物学》（第二版），朱玉贤、李毅编著，高等教育出版社，2007 年；《分子生物学》，郜金荣，叶林柏编著，武汉大学出版社，2007年；《分子生物学简明教程》，刘永明主编，化学工业出版社，2006年；《精要速览系列：分子生物学》（第3版）（中译版），特纳（Phil Turner）著，科学出版社，2010年；一、课程在培养方案中的地位、目的和任务分子生物学(molecular biology)是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学。
分子生物学的理论和方法已在生命科学、医学和工农业生产等各个领域里得到广泛应用。
通过本课程的学习应使学生了解生命科学发展的方向与前沿，了解分子生物学在生命科学等领域的应用与前景。
使学生掌握分子生物学的概念、研究内容与特点，掌握生命活动中重要的生物大分子的结构与功能、遗传信息的表达及其调节控制等内容。
二、课程基本要求(一) 基本理论和基本知识1. 掌握分子生物学的概念、研究内容与特点；2. 了解基因概念的演变，掌握基因的概念，及核算分子的精细结构与功能；3. 掌握原核生物与真核生物基因组的结构及特点；4. 掌握DNA 复制的一般特点及过程，掌握基因突变和遗传重组的分子机制；5. 理解转录的基本过程、机制；掌握真核RNA 的转录后加工；6. 掌握蛋白质合成的生物学机制；7. 掌握原核基因表达调控模式和真核基因表达调控的一般规律，深刻理解基因表达的精细性和复杂性及高度可调控性；(二) 基本技能1. 掌握质粒DNA、RNA的提取和检测方法；2. 掌握PCR方法，及感受态制备和转化筛选方法；3. 了解生命科学发展的方向与前沿，及其在有关领域的应用与前景。
《分子生物学》课程培养学生思维的几种教学方法
变 为形 象 、 体且 易 于接 受 的知识 关 系到 教学 的最 具 终 效果 ， 采用 形象 化 比喻 的方 法是 比较简 单有效 的． 如在 讲 授操 纵 元 时将 Ｒ Ａ聚 合酶 与 启 动子 序列 结 Ｎ 合 比喻成夫妻 的关 系 ， 诱导 物 比喻成第 三者 ， 样 把 这
可 以使 学生 理解 三者 之 间 的作 用 关 系 ， 当然也 有 无
力 作用 而离 婚 的例子 ， 具 体 讲解 后 继 内容 时可 以 在
进 一 步延伸 这个 比喻． 过 这 样 一个 简 单 的 比喻 不 通
作者简介 ： 孙妹兰（ ９ ５ ） 女 ， １７ 一 ， 黑龙 江北安人 ， 博士 ， 副研究员 ，ｍａ ： ｎｌ ＣＵ ｅｕ ｃ Ｅ ｉ ｓ ｓ＠Ｓｎ ．ｄ ．ｎ ｌｕ
华 南 师 范 大 学 学报 （自然科 学版 ）
２１ ０ ０年 １ 月 ０
０ｃ ．２０ ０ ｔ １
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｓ ＯＵＴ ＣＨＩ Ｈ ＮＡ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩ ＶＥＲＳ ｒ ｒ｜ Ｙ
精 品课 程 研 究 与 应 用 专辑
（ 刊） 增
（ Ａ ＵＲ ＣＥ Ｃ ＤＴ Ｏ Ｎ Ｔ ＡＬＳ Ｉ Ｎ ＥＥ ＩＩ Ｎ）
突 出贡献 ， 王晓东 因此被 评为 美 国科 学 院院士 ． 及 这 不仅 增强 了学 生 的 民族 荣誉 感 ， 增 强 学 生科 研 的 也 兴趣 和信心 ．
要． 以下是作 者在 授课 中尝 试采用 的教 学方 法．
１ 培 养 学 生对 生物 科 学 的 兴趣
作 者在 “ 前言 ” 绍分 子 生 物学 的 发展 简 史 ， 介 同
程 ，分 子生 物 学》 程 的教 学 具 有 挑 战性 ． 教 与 《 课 在
分子生物学讨论课-遗传病基因诊断
生物芯片技术：
根据生物分子间特异性相互作用，
将生化分析过程集成于芯片表面，从而实
现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物
成分的高通量快速检测分析。
常见芯片种类：
疾病诊断芯片 个性化用药芯片
景 广 阔芯 的片 基技 因术 诊是 断应 技用 术前
DNA
基因诊断策略
在分子发病机制水平上对 不同疾病的区分 诊断策略各不相同
基因诊断常用的分子生物学技术
核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） DNA序列测定 生物芯片/DNA芯片 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP
） 单核苷酸多态性（SNP）
进应
行用
核酸分子杂交基本原理：
基核
——核酸变性和复性理论 和因酸
分的分
核酸分子杂交 基本过程
5. (- 3.7 / --SEA ) 2.0kb; 1.3kb
6. (/--SEA )
1.8kb; 1.3kb
-珠蛋白基因型 PCR产物片段长度
•- 3.7 •
2.0kb 1.8kb
临床报告单－－样式
α-地中海贫血点突变基因检测
临床意义：
作为 -地中海 贫血三种缺失型的 补充，对怀疑 地中海贫血有漏诊 的患者进行 CS、 QS、 WS点突变 的诊断（课同时检 测），确定具体的 基因突变类型
临床β-地中海贫血基因诊断结果判读
654M/71-72M 17M/N βEM/βEM 41-42M/N
临床报告单－－样式
α-地中海贫血
α地中海贫血的 基因缺陷主要为缺失 型，α基因共有四个 (父源和母源各两个)， 缺失一个为静止型， 缺失两个为标准型， 缺失三个为HbH(β4) 病，缺失四个为 HbBarts(γ4)胎儿水肿 (死胎)。
2019-9-6第二次分子生物学研究方法
应用mRNA差别显示技术 分离克隆目的基因
1992年，美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学 家P. Liang和A. D. Pardee发明了一种叫做mRNA差别显示 PCR（mRNA differential display）技术，简称DDRT-PCR， 可以从一对不同类型的细胞群体有效地分离并鉴定差别表达 的基因。
目的基因
限制性内切酶
（二）克隆载体的选择和构建
分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并 携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA 分子。
将重点讲述 分子克隆载体的特点; 常见分子克隆载体;
分子克隆体总述
１、载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力 为外源基因的扩增提供必要的条件
２、载体特点
GGATCC CCTAGG
载体自连
重组体
目的基因自连
目录
不同限制酶切位点的连接
Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点
G A A T T C C T T A A G
A G A T C T T C T A G A
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
目录
一、制备用于克隆cDNA的mRNA
mRNA的制备 动物细胞mRNA的制备 植物细胞mRNA的制备
关键问题：制备mRNA(参考书p172)
二、cDNA第一链的合成
１、oligo(dT)引导的DNA合成法：
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入 12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
“专题式讨论”在《分子生物学》课程中的应用
科技创新导报 2019 NO.13
Science and Technology Innovation Herald
“专题式讨论”在《分子生物学》课程中的应用①
战欣 (海南大学海洋学院 海南海口 570228)
1 讨论专题的选择 本门课 程 共 设 立“亲 子鉴 定、线 粒体 基因组、肠 道 微
生物和性别决定机制”四个专题，这四个专题是根据日常 生活和 重 要水产 养 殖物种在分 子生物学 方面的最 新 研 究 进 展 设 置的，采用国内知名高校公 开发 表的硕士、博士 论 文以及视频资料，将分子生物学的理论知识与课外资料中 的实验结合起来，让学生感受到分子生物学在日常生活和 水产养殖专业领域的重要作用，同时也让学生了解和掌握 文献阅读和实验设计的技巧。
2 “专题式讨论”的组织方式 在 开 学 第一 次 课 堂 上，教 师 需向学生 介 绍设 置“专题
式讨论”的目的和意义，介绍每个讨论题目涉及的分子生物 学方法和原理，讲解如何在数据库中搜索各高校学生的硕 博士论文；学生自行组队，每个团队由4~5人组成，选择一个 本团队感兴趣的题目进行资料查找、组内讨论和ppt制作， 每 个 讨 论 题目由两组学生 完成，一组 完成与日常生活相关 的研究方向，另一组完成与水产养殖相关的研究方向，每 次理论课安排同一讨论题目的两组学生进行专题内容的讲 解；为了让所有的学生都认真准备本组的讨论内容，课堂展 示时本组所有成员轮流上台进行讲解，每人约3~5min，每组 讲解PPT时间不超过15min，课堂展示结束后，由展示小组 的学生对听课学生进行提问，之后由听课学生向展示小组 成员进行提问或提出不同观点进行讨论，讨论时间控制在 10min左右，由教师根据讨论情况，将学生讨论不到位的内 容进行补充、对错误的观点进行纠正、并总结和强调学生 需要掌握的主要知识点。最后，教师给展示组的学生和被 提问以及主动发表观点的学生打分。
生物化学与分子生物学讨论课(含答案版)
自身免疫性疾病
免疫相关基因表达失调， 引发免疫系统攻击自身组 织。
靶向药物设计原理及应用实例
原理
针对疾病相关基因或其产物，设计特 异性药物，通过干预基因表达或蛋白 质功能达到治疗目的。
酪氨酸激酶抑制剂
针对癌症中过度表达的酪氨酸激酶， 抑制其活性，从而阻止癌细胞增殖。
B细胞活化因子抑制剂
针对自身免疫性疾病中B细胞过度活 化的问题，抑制B细胞活化因子，降 低免疫反应。
氮代谢途径及调控机制
氨基酸的代谢
包括氨基酸的脱氨基作用、转氨基作用和 联合脱氨基作用，产生氨、α-酮酸和相应 的氨基酸。
氮代谢的调控机制
包括激素调节（如生长激素、胰岛素和胰 高血糖素）和基因表达的调节（如转录因 子和表观遗传学修饰）。
氨的代谢
氨在肝脏中可转化为尿素排出体外，也可 通过谷氨酰胺合成途径储存于肌肉等组织 中。
糖酵解途径
将葡萄糖分解为丙酮酸，产生 ATP和NADH。
糖原合成与分解
储存和释放葡萄糖以维持血糖 水平稳定。
糖代谢的调控机制
包括激素调节（如胰岛素和胰 高血糖素）和酶活性的调节 （如别构效应和共价修饰）。
脂类代谢途径及调控机制
甘油的合成与分解
甘油可由糖酵解中间产物磷酸二 羟丙酮转化而来，也可通过脂肪 动员分解为甘油和脂肪酸。
应用领域拓展
基因工程、基因治疗、生物制药、农 业生物技术等领域广泛应用，如生产 重组蛋白药物、基因诊断试剂盒、转 基因作物等。
PCR技术原理及在科研中应用举例
PCR技术原理
利用特异性引物和DNA聚合酶，在体外快速扩增特定DNA片段的一种分子生 物学技术。
在科研中应用举例
用于基因克隆、突变分析、DNA序列测定、基因表达研究等，如检测新冠病毒 核酸、分析基因突变等。
分子生物学讨论课
分子生物学讨论课好嘞，以下是为您创作的关于“分子生物学讨论课”的文案：咱今天来聊聊分子生物学这门神奇的课！我还记得刚开始接触分子生物学的时候，那感觉就像是走进了一个充满神秘密码的世界。
有一次，我在实验室里观察细胞的分裂过程，那一个个小小的细胞，就像是有着自己想法的小精灵，不断地变化着、运动着。
我紧紧地盯着显微镜，眼睛都不敢眨一下，生怕错过了任何一个精彩的瞬间。
在分子生物学的讨论课上，那场面可热闹了！同学们就像是一群好奇的探险家，每个人都带着自己独特的观点和疑问。
有的同学对基因的转录过程充满了好奇，不停地追问老师各种细节；有的同学则对蛋白质的折叠机制发表着自己的看法，那认真劲儿，仿佛自己就是一位专业的科学家。
老师也不含糊，总是能巧妙地引导着我们的讨论。
记得有一次，我们在讨论 DNA 复制的准确性问题。
有个同学提出：“为啥 DNA 复制能那么准确呢？万一出错了可咋办？”老师笑了笑，没有直接回答，而是先让我们自己思考。
大家七嘴八舌地讨论起来，有的说可能是有什么神奇的纠错机制，有的说也许是酶的作用。
最后，老师才给我们详细讲解了其中的原理，原来是一系列复杂而精妙的过程在保证着复制的准确性，听得我们恍然大悟。
还有一次，我们讨论基因编辑技术。
这可真是个热门话题！有的同学担心基因编辑会带来伦理问题，有的同学则看到了它在治疗疾病方面的巨大潜力。
大家争论得面红耳赤，谁也说服不了谁。
最后老师总结说，技术本身没有对错，关键在于我们如何合理地运用它，造福人类。
分子生物学里的那些概念和理论，有时候真让人头疼。
比如说，什么是基因表达调控？这就像是一个复杂的交通指挥系统，各种分子信号在细胞内传递，指挥着基因什么时候该表达，什么时候该沉默。
还有那个蛋白质的三维结构，要搞清楚它可不是一件容易的事儿，就像解一个超级复杂的谜题。
不过，正是因为有这些挑战，才让分子生物学变得如此有趣。
每次在讨论课上，当我们通过大家的交流和思考，一点点地揭开这些谜题的时候，那种成就感简直无法形容。