实验二 细胞器的分离与提纯
细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察高熹1120152430（李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。
关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。
1 引言差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。
细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。
【新教材生物一轮复习】必修1 第2单元 第2讲 细胞器之间的分工合作
类和包装 的“车间”及“发送站”。
4．④内质网：蛋白质等大分子物质的合成、加工场所和运输通 道__。
5．⑤液泡：内有细胞液，调节植物细胞内的环境，充盈的液泡 还可以使植物细胞保持坚挺，主要存在于植物细胞中。
6．⑥溶酶体：细胞内的“消化车间”，内部含有多种水解酶， 能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死 侵入细胞的病菌或病毒。
细胞结构中的“一定”与“不一定” (1)具有细胞壁的细胞不一定是植物细胞，如真菌、细菌等都有 细胞壁(注意细胞壁的组成成分不同)。 (2)能进行光合作用的生物，不一定有叶绿体(如蓝细菌)，能进行 有氧呼吸的生物不一定有线粒体(如好氧细菌)。
(3)蛋白质合成场所一定是核糖体，核糖体的形成不一定都与核仁 有关(如原核细胞没有核仁，但有核糖体)。
的选择透过性。
( ×)
提示：依赖于生物膜的流动性。
4．生物膜之间通过囊泡运输依赖膜的流动性且不消耗能量。 ( ×)
提示：囊泡运输消耗能量。
5．分泌蛋白先经过高尔基体再经过内质网分泌到细胞外。 ( ×)
提示：分泌蛋白先经过内质网，再经过高尔基体分泌到细胞外。
6．CO2 的固定、水的光解、蛋白质的加工均在生物膜上进行。 ( ×)
C [a 为线粒体，NADH 与氧结合形成水是有氧呼吸第三阶段， 该反应发生在线粒体内膜上，线粒体内膜折叠形成嵴，A 正确；b 为 叶绿体，直接参与光合作用的膜是类囊体薄膜，膜上有光合色素， 发生光反应，B 正确；与光合作用有关的酶没有分布在叶绿体内膜上， C 错误；线粒体中发生化学能转化成热能，叶绿体发生光能转化成 化学能，两者可共存于同一个细胞中，D 正确。]
高中生物--细胞器习题(带答案)
判断正误并找到课本原文1．细胞质基质呈溶胶状，是代谢的主要场所。
( )2．分离细胞器的方法——差速离心法。
( )3．线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞的“动力车间”。
( )4．叶绿体是绿色植物所有细胞含有的细胞器。
( )5．液泡可以调节植物细胞内的环境、充盈的液泡还可以使植物细胞保持坚挺。
( ) 6．内质网是蛋白质等大分子物质的合成、加工场所和运输通道。
( )7．溶酶体是细胞的“消化车间”，内部含有多种水解酶，能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病毒或细菌。
( )8．细胞骨架是由蛋白质纤维组成的网架结构，与细胞运动、分裂、分化及物质运输、能量转化、信息传递等生命活动密切相关。
( )9．观察叶绿体时可选取菠菜叶稍带些叶肉的上表皮细胞。
( )10．研究分泌蛋白合成和运输的方法是同位素标记法。
( )11．在分泌蛋白的合成、加工、运输的过程中，需要消耗的能量全部来自线粒体。
( ) 12．在分泌蛋白合成、加工、运输过程中，高尔基体起着重要的交通枢纽作用。
( ) 13．生物膜的组成成分和结构相似，在结构和功能上紧密联系。
( )14．生物膜把各种细胞器分隔开，使细胞内能同时进行多种化学反应，而不会互相干扰。
( )细胞可以清除功能异常的线粒体，线粒体也可以不断地分裂和融合，以维持细胞内线粒体的稳态。
下列有关线粒体的叙述，错误的是()A．线粒体具有双层膜结构，内、外膜上所含酶种类相同B．线粒体是真核细胞的“动力车间”，为细胞生命活动提供能量C．细胞可通过溶酶体清除功能异常的线粒体D．细胞内的线粒体数量处于动态变化中易错判断1．哺乳动物红细胞、蛔虫、原核生物因为没有线粒体，所以不能进行有氧呼吸。
() 2．蓝细菌、光合细菌无叶绿体也能进行光合作用。
()3．植物细胞不一定都有叶绿体，如根尖细胞。
()4．脂质(如性激素)的合成场所：内质网。
()5．液泡是最大的细胞器，且液泡里的色素种类与叶绿体一致。
()6．线粒体、叶绿体、溶酶体内存在核糖体。
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法一、原料选择和前处理（一）原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理1.细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
细胞器的分离与观察
4.14沉淀用1ml0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次，每次1000g（3900r/min）离心10min；
4.15纯化：将沉淀用500μL0.34mol/L蔗糖溶液悬浮，然后用注射器加入0.88mol/L蔗糖溶液400μL，1500g（4800r/min）离心15—20min；
4.16用PBS溶液悬浮——干燥——95%乙醇固定（5min）——甲基绿-派洛宁染色20-30min——丙酮分离30S——蒸馏水漂洗——吸干镜检；
2.实验原理、试验流程或装置示意图
2.1新鲜取出的小鼠肝脏为组织块，为了得到细胞核和线粒体，首先需要进行匀浆，将细胞从组织块中分离出来，然后再经过进一步匀浆，使细胞膜破碎，细胞解体，各种细胞器被分离出来；同时，0.25mol/L蔗糖溶液，使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下，使得细胞更容易破碎，匀浆彻底；
4.实验方法步骤及注意事项
4.1实验方法步骤：
4.11称取0.5g小鼠肝脏置于小烧杯中，用解剖剪将其剪碎，然后用生理盐水清洗数次，最后用0.25mol/L的蔗糖溶液清洗一次；
4.12将清洗好的小鼠肝脏置于玻璃匀浆器中加入1.5ml0.25mol/L的蔗糖溶液即可进行细胞匀浆，待其充分匀浆后备用；
4.13取1.5ml匀浆置离心管中，600g（3000r/min）离心10min，上清液留作线粒体分离；
叶绿体的分离、纯化和鉴定.pdf
(2)细胞破碎时，不必过细。用普通的家用食品 料理机匀浆2 min同样可以达到很好的效果。此 外，过滤时不要用力挤压，以避免对叶绿体被膜 的破碎。在用细胞器分离缓冲液悬浮叶绿体粗提 物时应轻缓，在冰上轻轻晃动使叶绿体分散开来。
心机配平)， 轻轻吸取上清液。 5. 在2.0ml离心管内依次加入50%蔗糖溶液0.9ml和15%蔗糖溶液 0.5ml（注意15%蔗糖溶液要缓缓沿离心管壁注入，不能搅动 50%蔗糖液面）。 6. 小心地沿离心管壁加入0.4ml上清液。 7. 离心8000r/min, 20 min。 8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度 液中间形成带。
冲液 ph=7.4） 50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液，0.01%吖啶橙
Байду номын сангаас
实验步骤
1.选取菠菜叶片（选择嫩绿色的新鲜叶片），洗净擦干后去除 叶梗和粗脉，撕成小碎块（剪碎更宜碾磨），称2~3g放于玻 璃匀浆器中
2.加入预冷（放在冰上预冷）到0℃匀浆介质10ml，在冰上用研 钵研磨。
3.捣碎液用尼龙网过滤于50ml烧杯中。 4.将滤液平分到2个离心管中（2ml），1000r/min下离心1min(离
(4)加样时一定要小心，防止破坏梯度。为此，应采用宽口 吸头吸取叶绿体粗提物悬浮液，释放时，将枪头贴于管壁 接近15％蔗糖浓度处缓慢释放。
(5)离心时，为防止速度快速上升和快速下降对浓度梯度层 的破坏，离心机的加速一定要缓慢，而下降时也要缓慢停 下。此外，为防止高速离心过程中温度上升可能造成的由 于颗粒扩散而引起的梯度破坏，离心前一定要让离心机在 0℃或更低的温度下充分预冷【1】。
9.用吸管对准叶绿体那一层吸取一滴叶绿体悬液滴于载片上， 加盖片观察： 1）在普通光镜下观察；
植物分离提纯实验报告
植物分离提纯实验报告引言植物分离提纯实验是一种常见的分析植物中活性成分的方法。
通过分离和纯化，可以获得高纯度的植物成分，进而进行进一步的结构鉴定和药理学研究。
本实验旨在通过提取、分离和纯化的方法，获得植物中的目标成分。
实验方法材料准备- 实验材料：植物样品（本次实验选用了蒲公英叶片），甲醇、乙醚、石油醚、氯仿、浓盐水、浓硝酸、无水钠硫酸、醚石等。
- 实验设备：量筒、均质器、漏斗、玻璃棒、试管、烧杯、离心机、显微镜、旋转蒸发仪等。
提取植物成分1. 收集新鲜的蒲公英叶片，彻底清洗并晾干。
2. 将蒲公英叶片粉碎，加入甲醇浸泡24小时，提取目标成分。
3. 使用均质器将叶片浸取的甲醇悬浮液进行均质处理。
4. 将混合物过滤，得到植物成分的甲醇提取物。
分离植物成分1. 将提取物转移到漏斗中，加入等体积的氯仿。
2. 加入适量的盐水，轻轻摇动漏斗，使两相分离。
3. 用玻璃棒搅拌植物中的非极性物质，与氯仿相溶。
4. 分离氯仿相得到目标非极性成分溶液。
纯化植物成分1. 取得目标成分溶液。
2. 加入等体积的乙醚并搅拌均匀，使其析出沉淀。
3. 将混合物离心，得到纯度较高的目标成分固体。
4. 通过旋转蒸发仪去除残留的有机溶剂，得到目标成分的纯化物。
结果与讨论在本次实验中，我们通过提取、分离和纯化的方法，成功获得蒲公英叶片中的目标非极性成分。
在提取过程中，甲醇作为有机溶剂可以较好地提取植物中的成分。
分离过程中的氯仿相对于目标成分具有较好的极性，使得目标成分独立于其他成分。
通过加入乙醚并进行旋转蒸发，我们获得了纯度较高的目标成分。
经过显微镜观察，我们发现提取物中含有大量的植物细胞和细胞器。
而经过分离和纯化后，目标成分固体呈现出白色结晶的形态，研究证明其为植物的次生代谢物，可能对该植物具有重要的药理活性。
然而，在本次实验中，我们只能通过形态观察获得目标成分的初步信息，还无法确定其化学结构和药理学特性。
进一步的研究还需依赖其他分析方法，如质谱分析和核磁共振等。
植物细胞分离实验报告
一、实验目的1. 熟悉植物细胞分离实验的基本原理和方法。
2. 掌握植物细胞器分离纯化的操作技能。
3. 了解不同细胞器在分离过程中的沉降特性。
二、实验原理植物细胞分离实验是细胞生物学和分子生物学研究的重要技术之一。
通过采用差速离心和密度梯度离心等方法，可以将植物细胞中的各种细胞器分离纯化，从而研究其结构和功能。
本实验采用差速离心法分离植物细胞中的线粒体和叶绿体。
三、实验用品1. 植物材料：洋葱鳞片叶或菠菜叶片。
2. 实验试剂：生理盐水、蔗糖、盐酸、缓冲液、龙胆紫染液。
3. 实验仪器：离心机、匀浆器、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、培养皿、铅笔。
四、实验步骤1. 细胞破碎：将植物材料放入匀浆器中，加入适量生理盐水，高速匀浆，破碎细胞。
2. 差速离心：将匀浆液转移至离心管中，以3000r/min的速度离心10分钟，分离出细胞碎片。
3. 叶绿体分离：将离心后的上清液转移至新的离心管中，以5000r/min的速度离心10分钟，分离出叶绿体。
4. 线粒体分离：将离心后的沉淀物重新悬浮于生理盐水中，以12000r/min的速度离心15分钟，分离出线粒体。
5. 染色：将分离出的线粒体和叶绿体分别加入适量龙胆紫染液，染色5分钟。
6. 观察：将染色后的线粒体和叶绿体分别滴在载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜观察。
五、实验结果1. 叶绿体：呈绿色，呈球形或椭球形，细胞器较大，直径约2-4微米。
2. 线粒体：呈蓝色，呈杆状或圆形，细胞器较小，直径约0.5-1微米。
六、实验讨论1. 在差速离心过程中，不同细胞器的沉降速度不同，因此可以通过调整离心速度和时间，实现细胞器的分离纯化。
2. 本实验中，叶绿体和线粒体的分离效果较好，说明差速离心法适用于植物细胞器的分离。
3. 实验过程中，要注意控制匀浆时间和离心速度，以免影响细胞器的结构和功能。
七、实验结论本实验成功分离出植物细胞中的叶绿体和线粒体，并通过显微镜观察了其形态特征。
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实验二细胞器的分离与观察
一、教学目的与要求
1. 学习利用差速离心法分离动物细胞的细胞器。
2. 掌握细胞核与线粒体的染色方法和现象。
二、实验原理
线粒体（Mitochondria，MT）是真核细胞特有的，进行能量转换的重要细胞器，有“细胞动力工厂”之称。
细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在线粒体中进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成A TP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。
在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。
三、实验用品
器材：冰箱、纱布、瓷研钵、高速冷冻离心机。
材料：新鲜的猪肝脏。
试剂：见PAGE 64
四、实验步骤
1. 制备猪肝细胞匀浆。
实验前购买新鲜猪肝脏备用。
割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml 冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2. 差速离心。
先将5ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入5ml 肝匀浆使其覆盖于上层，用高速冷冻离心机进行差速离心。
3. 滤液经700×g离心10min，分离核和杂质沉淀。
4. 取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。
5. 沉淀经再次洗涤、离心后，即可得到纯度较高的线粒体。
5. 分离物鉴定。
①细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，加甲醇-冰醋酸液1滴固定15min，充分吹干，滴1滴姬姆萨染液染色10min。
自来水冲洗，吹干，镜检。
结果：细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片。
②线粒体：取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密)，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染色20min，覆上盖玻片，镜检。
线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
取猪肝2g
用预冷的0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤3次，
研磨成匀浆
匀浆液
多层纱布过滤，
700×g 离心10min
沉淀上清液
10000×g离心
10min 10ml 0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤2次
每次1000×g离心15min 沉淀（线粒体）
沉淀洗涤
（细胞核及质膜碎片） 10ml 0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤2次,
每次10000×g离心15min
镜检
沉淀
镜检
五、作业
1、根据镜检结果，绘制线粒体结构简图。
2、分离得到的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置2h后染色，两者着色有何不同。