单个细胞分离技术PBMC教材
免疫细胞的分离及检测技术课件
Ficoll分离液---聚蔗糖-泛影葡胺溶液
➢2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1 份34%泛影葡胺生理盐水溶液， 比重为1.077± 0.002
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
二 、淋巴细胞分离
（去单核细胞）
➢ 贴壁粘附法 ➢ 吸附柱过滤法 ➢ 磁铁吸引法 ➢ Percoll 分离液法
二、B细胞表面标志
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活 细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死 亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细 胞而使细胞着色（蓝色）。
第二节 淋巴细胞标志及亚群分类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。
➢ 根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分 子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细 胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B 细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标， 以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1 和B2两个亚群；目前多以CD3-、 CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标 志。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以 CD16、CD56来认定，临床上将 CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为 NK细胞。
T细胞及NK细胞
第三节 其他的免疫细胞
抗原提呈类细胞表面标志
单个细胞分离技术PBMC
1个大方格中16个中方格
计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
4个大方格内 细胞总数
单个核细胞总数/ml=
一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）
（一）葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞
• 密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自然停转
1.分离液：葡聚糖-泛影葡胺混合液（比重1.075～1.092之间） 将分离液，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分离 液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。
◆红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层， ◆单核细胞比重较小（1.075～1.090），分布于血浆与分离液的
单个核细胞
分离液 粒细胞 红细胞
用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内 加入PBS洗液3-4ml，离心洗涤2次，1500/r,10min. 弃去上清，留约50μl. 加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml，混匀充池，镜下计数。
肝素抗凝血2ml +Hank’s液2ml液稀释 方法
分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。
【结果判定】
活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测
• 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器：
4
× 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104
单个核细胞分离及E花环形成试验 医学课件
主要的试剂和器材
• Ficoll分层液 • 250U/ml 肝素溶液 • 5g/L台盼兰 • Hanks液、含20％灭活小牛血清的Hanks液 • 注射器、一次性试管、一次性吸管、细胞计数板、
实验结果
• PBMC计数结果记录和计算
• 单个核细胞活力计数结果记录和活力计算
注：死细胞染成蓝色，活细胞不染色
注意事项
• 将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高 单个核细胞的收获量。
• 分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。
• 将稀释的全血加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以 影响分离效果。
• 该方法简便易行，曾被广泛应用，但影响因素 较多，结果偏差较大，已经被CD抗原免疫检测 法取代。
Байду номын сангаас
同学们：
中午离开前，请将细胞计数板冲洗干 净，关闭显微镜光源。下午实验后，请 将使用过的一次性器材丢入垃圾桶，使 用过的玻璃器材冲洗干净后放入水槽边 上的回收桶中，整理好自己的台面再离 开！
值日生请认真做好本职工作！
E花环形成试验
实验原理
• 人外周血中的T细胞表面具有能与绵羊红细胞 （SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体 （CD2）。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面 标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细 胞表面，呈现花环状。通过花环形成检测T细胞的方 法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可 测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能 状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。
单个细胞分离技术PBMC
临床免疫学实验指导
海南医学院
实验六 单个核细胞分离及细胞免疫功能检测 【实验目的】 1.熟悉淋巴细胞分离方法 2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义
T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的 单个核细胞（L, M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞
（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.
计数池区域 一个计数全池 大方格 白细胞中方格 红细胞中方格 红细胞小方格 边长（mm） 3 1 0.25 0.20 0.05 面积（mm2） 池深（mm） 9 1 0.0625 0.0400 0.0025 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 体积（mm3 ul） 0.90 0.10 0.00625 0.00400 0.00025
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值： 60%-80%
由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显
结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。
T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）
人类T细 胞的主要 标志 的CD2、 CD3和 TCR均 能吸附 绵羊红 细胞于淋 巴周
围，形
4个大方格内 细胞总数 4 × 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml=
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104 关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤 离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。
资料：SOP-CC-PC-002-00 PBMC分离标准操作规程
XXXX 生物科技有限公司文件编码SOP-CC-PC-002-00文件页数共 4 页文件名称PBMC分离标准操作规程颁发部门：审核人：批准人：起草人：审核日期：批准日期：起草日期：分发部门：生效日期：变更记载变更原因及目的：修订号批准日期执行日期PBMC分离标准操作规程【目的】：规范化细胞培养中外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分离操作。
【范围】：应用于细胞培养过程中患者单个核细胞的分离。
【责任】：实验室负责人、细胞培养操作人员及PBMC技术应用人员对本规程负责。
【内容】：背景介绍：本操作规程应用于外周血单个核细胞（PBMC）的分离，分离方法为密度梯度离心法：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
细胞分离液的主要成分Ficoll为蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，密度约为1.2g/ml。
在细胞分离过程中Ficoll 试剂不会超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
将全血细胞加载于Ficoll液面上，由于红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底液体分为四层；最上层为血浆，淋巴细胞和单个核细胞的比重小于或等于Ficoll试剂比重，离心后处于血浆下层，漂浮于分离液的液面上；最下层为血小板、红细胞、粒细胞等。
吸取第二层细胞（俗称白膜层）液面的细胞，就可从外周血中分离得到单个核细胞。
1操作时间采血后得到的血样应在采血后6小时之内进行PBMC分离操作，以防止凝血、溶血发生。
血样在采血后越短时间间隔内处理得到的PBMC活性越好。
2设备、耗材和试剂2.1 设备生物安全柜、台式大容量离心机、生物倒置显微镜、二氧化碳培养箱、涡旋振荡器、生化培养箱2.2 耗材50ml离心管、250ml离心管、5ml移液管、10ml移液管、25ml移液管、200μl吸头、1.5ml计数管、T175细胞培养瓶2.3 试剂Ficoll试剂、生理盐水、细胞培养基、Turk液、台盼蓝、哥伦比亚血平板3操作流程3.1 操作前准备3.1.1 开启生物安全柜，运行10分钟后方可在生物安全柜内进行PBMC分离操作。
外周血单个核细胞的分离及其寿命
外周血单个核细胞的分离及其寿命外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)外周血单个核细胞外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。
红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
分类表：血细胞寿命1、红细胞-携带氧的“运输兵”红细胞是血细胞中最多的细胞，内含血红蛋白，它能把人体从肺部吸入的氧气结合后，通过备注徨再释放给各组织，因此被称为携带氧气的“运输兵”。
红细胞的平均寿命为120天，每天均有细胞衰老、死亡、也就是说，每天约有20亿个红细胞死亡。
2、白细胞—人体健康的“卫士”白细胞能吞噬进入人体的细菌和病毒以及代谢产生的对人体有害的“异物”，白细胞还有免疫功能。
白细胞的平均寿命很短，约7-14天。
粒细胞在骨髓内经10天左右释放入血液，在血液不到1天然后溢出血管进入组织或体腔内。
在组织或体腔内可以行使防御功能2－3天。
素爱老的粒细胞被单核-巨噬细胞系统清除，也有一部分从口腔、气管、消化道和泌尿生殖道排出。
淋巴细胞：B淋巴细胞寿命较短，一般3－4天，景观抗原刺激后分化为浆细胞，产生特异性抗体，参与体液免疫。
T淋巴细胞寿命较长，可达数月，甚至数年，经抗原致敏后，可产生多种免疫活性物质，参与细胞免疫。
单个细胞分离技术PBMC概要
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
• 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器：
细胞存活率 = ×100% 活细胞数+死细胞数 200 例如：活细胞总数为 120个，存活率为：60%； 若活细胞计数为180个，存活率：90%
活细胞数(N)
【临床意义】
分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一， 是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作； 是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。 分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要， 不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，
取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl， 混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻， 置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞 分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。
【结果判定】
活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
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• 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器：
细胞存活率 = ×100% 活细胞数+死细胞数 200 例如：活细胞总数为 120个，存活率为：60%； 若活细胞计数为180个，存活率：90%
活细胞数(N)
【临床意义】
分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一， 是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作； 是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。 分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要， 不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，
梯度离心法——分离提取单个核细胞
稀释血浆 内含血小板 2000rpm/ 20-30min
单个核细胞
分离液
粒细胞
红细胞
用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内 加入PBS洗液3-4ml，离心洗涤2次，1500/r,10min. 弃去上清，留约50μl. 加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml，混匀充池，镜下计数。
临床上反复感染者和肿瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有 细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫缺陷的检测，而这种检查的 第一步就是单个核细胞的分离，计数。然后进行功能检查。
一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）
（一）葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞
• 密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自然停转
1.分离液：葡聚糖-泛影葡胺混合液（比重1.075～1.092之间） 将分离液，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分 离液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。 ◆红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层， ◆单核细胞比重较小（1.075～1.090），分布于血浆与分离液的 交界处。界限清楚，层次分明。将该层细胞吸出，即为单个核 细胞（主要为淋巴细胞） ◆血浆和血小板位于最上层。血小板在血浆中下部 2. Hanks缓冲液：（ pH 7.2-7.4,无Ca、Mg离子） 3. 0.4%台盼蓝染液
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临床免疫学实验指导
海南医学院
实验六
单个核细胞分离及细胞免疫功能检测
【实验目的】 1.熟悉淋巴细胞分离方法 2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义
T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的 单个核细胞（L, M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞
（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.
4个大方格内 细胞总数 4 × 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml=
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104 关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤 离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。
此缓冲液中的单个核细胞密度。
细胞存活率检测
也用于，各种标志物以及其他淋巴细胞功能测定等。
实验报告：
1. 报告单个核细胞计数总数结果 2. 报告单个核细胞存活率 3. 简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理 4. 分离单个淋巴细胞的临床意义 T细胞总数测定：Et花环实验。学生课余自学内容。
计数池区域 一个计数全池 大方格 白细胞中方格 红细胞中方格 红细胞小方格 边长（mm） 3 1 0.25 0.20 0.05 面积（mm2） 池深（mm） 9 1 0.0625 0.0400 0.0025 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 体积（mm3 ul） 0.90 0.10 0.00625 0.00400 0.00025
取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl， 混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻， 置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞 分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。
【结果判定】
活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测
静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。
具体计数方法如下：
▲
血细胞计数池的构造
1. 大方格
9个
2. 中方格分2种 WBC计数区分16个
RBC计数区分25个
3.小方格1种， 是指RBC计数区 的1个中方格又分 16个小方格，即：
计数池内有：1种
大方格；2种中方 格；1种小方格 池深 0.1mm
血细胞计数池的构造参数 4种方格的体积（容积）
肝素抗凝血2ml +Hank’s液2ml液稀释
方法
沿管壁缓慢加入到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中 (不能破坏二者的液面）,2000r/min 离心20min 吸出淋巴细胞层加入另一试管中，加3～4ml Hank’s液， 混匀离心洗涤， 1500r/min 离心10min 弃去上清，再加3ml Hank’s液，混匀， 1500r/min 10min，重复洗涤2次 重复1次
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
留取约50μl,加缓冲液至1.0ml，稀释20倍
末次离心后，弃去上清液。加含10%灭活小牛血清/HanK‘s液 加至1.0ml，混匀，灌入血细胞计数池，单个核细胞计数， 于低倍镜下计数4个角大格内细胞总数。
计数细胞方法
加样： 将淋巴细胞悬液混匀，吸取10μl加入到 40μl含10%灭活小牛 血清的Hank’s液中，混匀后再吸取10μl充入计数板上。 细胞悬液稀释5倍。此稀释也可省略，可根据细胞密度而定
E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值： 60%-80%
由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显
结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。
T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）
人类T细 胞的主要 标志 的CD2、 CD3和 TCR均 能吸附 绵羊红 细胞于淋 巴周