间充质干细胞

间充质干细胞通过大动脉内皮细胞时表现稳定的粘合性，表面分布不均、分散性及跨迁移的特征即；趋化因子与切力效应作者：Giselle Chamberlain, Helen Smith, G. Ed Rainger, Jim Middleton 摘要间充质干细胞具有抗炎症，抑制免疫力的性质，或许在如动脉硬化这样的疾病治疗中发挥作用。

间充质干细胞能够进入炎症细胞，然而为了在临床上运用，人们需要阐明他们迁移机制。

本研究探究了鼠类间充质干细胞与其迁移到小鼠动脉内皮细胞的相互关系，以及趋化因子，剪切压力的效应。

通过生理流动条件实验研究鼠类间充质干细胞与MAEC 的相互作用，鼠类间充质干细胞在连续流动条件下没有表现出相互作用。

然而，当流动停止十分钟，再开始，鼠类间充质干细胞慢慢的附着在内皮细胞表面，延展成良好的微绒毛过程（丝足）。

然后他们以不同方向散布在伸展的丝足。

CXCL9显著提高了鼠类间充质干细胞的附着、表面非均匀分散及扩散的比例，剪切压力明显刺激了后两者。

间充质干细胞通过鼠类动脉内皮细胞过程中，CXCL9, CXCL16, CCL20 和CCL25 明显增强了跨内皮迁移。

小鼠间充质干细胞的跨迁移抑制受体CXCR3，CXCR6, CCR6 和CCR9. 本研究促进了对间充质干细胞内皮跨迁移，趋化因子、剪切压力的效应的了解，这与如动脉硬化的炎症息息相关。

介绍间充质干细胞分化成许多不同的细胞谱系的能力，如同他们抗炎及免疫方面的特征，都没有伦理上的争议；培养相对容易使得间充质干细胞在许多炎症与损伤的治疗中成为一种理想的干细胞来源[1]。

间充质干细胞能够在动脉硬化的抗炎治疗中发挥作用，有报道用培养的间充质干细胞治疗心肌梗塞[2–4]；同样，在像中风，脊椎损伤[5,6]、脑脊髓炎[7]、辐射损伤[8]、皮肤损伤[9]和移植物抗宿主疾病情况[10]，间充质干细胞发挥潜在作用。

虽然在治疗像非愈合骨折这样的特点疾病下[11]，间充质干细胞定向移动发挥作用，但是它也与间充质干细胞周身侵泡配合问题有关，如钙化与组织损伤[12]。

周身移动带动多向移动，而且可能比定向传递更少发生侵略性的过程。

为了通过周身递送直接治疗动脉硬化，间充质干细胞需要横穿动脉内皮进入组织发挥抗炎效应，然而通过这样途径间充质干细胞迁移、移植并不非常有效[13]，还需要了解间充质干细胞从血液到组织是怎样迁移的，以至于这样的补充过程能够减少炎症的发生与增强组织修复。

我们已经非常了解多层附着的白血球及这些细胞是如何从循环中迁移到炎症组织中的[14,15]。

白血球在细胞内皮表面进行一系列相互作用，如结合，旋转，激活，捕捉，传递，蠕动，接着进行跨内皮迁移。

然而，我们不知道间充质干细胞是否与内皮细胞发生相似的作用，也不知道哪些因子调控跨内皮迁移。

除此之外，间充质干细胞与内皮细胞相互作用在循环中产生生理作用即流体剪切压力需要得以解决，因为这队白血球非常重要[16].趋化因子受体与配体是重要的组分涉及在白血球细胞移动到炎症位点，最近我们阐明了在标准Boyden-type 小室中，用去掉内皮细胞后，鼠类间充质干细胞上不同趋化因子受体的功能表达。

我们和其他人报道了[17–22]在人类间充质干细胞中趋化因子受体表达，其中与一些鼠类相同（如CXCR3,CXCR6 和CCR9因子）。

我们了解有许多白血球附着分子参与细胞横穿内皮组织的迁移过程，有报道其中一些在间充质干细胞上表达[23,24]。

对间充质干细胞附着内皮组织产生重要功能的附着分子对群有CD44, VCAM-1及其相反配基VLA-4和其他b1结合蛋白[25–28]。

然而，人们很少了解间充质干细胞内皮反向迁移的机制与趋化因子在驱动这种机制上的作用。

最近有两个研究实验探究了在体外静态条件，通过内皮细胞与间充质干细胞的共培养下跨内皮迁移过程[27,29]。

他们都发现当内皮细胞被炎症细胞因子刺激，间充质干细胞表现了形态学的变化及与内皮单层细胞结合。

他们也发现间充质干细通过原生质突起进入内皮细胞，分泌MMP-2（基质金属蛋白酶）,它是一种促进造血干细胞运输的基底膜上退化膜酶[30]。

现在研究的目标致力于研究鼠类间充质干细胞附着于鼠类大动脉内皮细胞的趋化因子效应与剪切力效应。

第一次发现与内皮细胞接触时间充质干细胞扩散蠕动，并在趋化因子刺激与剪切力作用下，得以增强。

趋化因子也促进鼠类间充质干细胞横穿大动脉内皮细胞的跨内皮迁移，这将下调被迁移的趋化因子受体细胞。

我们先前提到了小鼠间充质干细胞表达存在于人间充质干细胞一些相同的趋化因子受体。

[17],因此进一步研究选择性趋化因子受体的作用，这些小鼠间充质干细胞可成为在动脉硬化与心肌梗塞体内模型中一种有用的模型。

方法:分离与扩培养小鼠间充质干细胞小鼠间充质干细胞从6-10周大小的小鼠获得，按照相关文献方法分离[17,31] ,这种符合伦理学方法来自英国欧斯威特的RJAH医院。

简单来说，骨髓来自长骨中，细胞来自细胞分离培养基(RPMI-1640 (英国龙沙公司) ，培养基中含有9%FBS，9%血清（两者皆来自英国杰生公司）并在37℃，5% CO2.。

在24小时后没有附着的细胞被去除，四周后，细胞在含有9%FBS，9%马血清的完全扩大培养基(CEM) (Iscove Modified Dulbecco Medium(Lonza)以每平方厘米一百细胞涂布来扩增间充质干细胞。

这些细胞对CD105具有95%的活性，而对CD45和CD34完全失效[17].当在成骨或脂质培养基生长时，分别对碱性磷酸酶与胞内脂质产生活性[17]。

小鼠内皮细胞的培养小鼠动脉内皮细胞株来自日本鹤见牙医大学Hiroko Inoue博士的馈赠。

此细胞株以缺失p53的小鼠动脉上获得的[32]。

细胞株拥有内皮细胞的表型，微贝尔-帕拉德小体，内皮组织标记和粘合分子。

此外，TNFa促进淋巴细胞附着在小鼠动脉内皮组织上，以此提供了在体外研究炎症与白细胞迁移的模型。

在199培养基(英国sigama公司) 37℃，5% CO2培养生长细胞，培养基中含有5%FBS，1U/ml肝素纳和5ng/ml小鼠VEGF （派普泰克公司）。

培养基每3-4天更换一次。

从LGC公司的Promochem (ATCC)(英国物理研究所) 购买了脑内皮细胞株，并起先从BALB/c系小鼠脑部内皮瘤分离得到[33,34]。

通过观察凝血因子的表达与摄取的荧光标记的低密度脂肪确定该细胞的内皮性质。

内皮细胞表达的其他分子也通过像CAM-1 and VCAM-1这样的细胞稳定表达，或者受到肿瘤坏死因子或脂多糖刺激而减少。

比如E-选择蛋白与P-选择蛋白生长在添加有抗体与10%FBS的DMEM 培养基上(Lonza)流动估测小鼠动脉内皮细胞接种在Ibidi 载玻片(Wolf laboratories,Pocklington, UK)，生长聚集，在37℃，用100 ng/ml 的小鼠TNF因子刺激16个小时。

然后用基质清洗；用100 ng/ml 小鼠CXCL9(MIG) 处理30分钟(Peprotech)（此步骤选作）。

在37℃注射器泵以一定的速率吸取载玻片液体以进行流量分析，同时通过相对的显微镜观察可以见到载玻片中细胞[35]。

在没有血清的培养基上小鼠间充质干细胞以(1*106/ml) ，0.1Pa，4分钟灌注微管中，然后用基质以同样的流速清洗15分钟。

记录影像过程分析间充质干细胞的行为。

小鼠间充质干细胞也以4*106/ml添加到微管中，然后无血清的培养基以0.1pa进行2小时的灌注。

自始至终每15秒拍摄照片来检查间充质干细胞与内皮组织的相互作用。

跨内皮趋化性试验具有8mm孔径滤膜器涂有来自Sigma公司的人类质粒的纤练蛋白(4 ug/ml in PBS) ，转移至24槽平板用sigmacote处理，以避免附着迁移的细胞。

将近4*105小鼠动脉内皮细胞将接种在每一个半透膜过滤网上，以100%聚集两天，再用无血清基质上的小鼠TNFa 因子在37℃培养4小时来激活该细胞。

留下三个没有刺激的样作为对照。

用含有8 mm Calcein-AM (Molecular Probes, Invitrogen)的pBS在37℃培养30分钟可获得小鼠间充质干细胞。

同时，含有（或无）小鼠CXCL9 (MIG), CCL20 (MIP3a), CCL25 (TECK) 和CXCL16 (Peprotech)培养基以不同的比例添加到具有24孔的平板上的滤膜器，每种条件做三次重复。

600,000 小鼠间充质干细胞添加到每一个滤膜器的上层37℃在无血清培养基悬浮，平板放置在37℃，5% CO2 和90% 湿度过夜16小时培养。

已经迁移至底层的小鼠间充质干细胞的数目用FLX800微板荧光阅读器(Bio-tek Instruments Ltd, Potton, UK)（本设备已建立荧光与细胞数比例的标准曲线）来计算。

所使用的每一个趋化因子数目是10 ng/ml。

这是基于先前所作的实验(0–1000 ng/ml) 即在Boyden-type趋化性评估中使用同样小鼠间充质干细胞[17]。

结果显示特别能刺激间充质干细胞迁移的最有效浓度是10 ng/ml 或100 ng/ml；低于10 ng/ml或高于500 ng/ml 的趋化因子不能刺激迁移[17]。

因此，在目前跨内皮迁移实验中使用10ng/ml和100ng/ml 的趋化因子，发现前者浓度对刺激间充质干细胞效果明显而后者产生重要结果。

液式细胞计检查来自跨内皮趋药实验或从含有胰蛋白酶与EDTA的烧瓶中分离得到的间充质干细胞在4℃在PBS与2%BSA的缓冲液中重悬60分钟。

缓冲液中含有10%的血清来阻止非特异结合。

通过台盼蓝鉴定到细胞具有超过95%的活性。

用饱和合适的含有第一抗体的缓冲液的间充质干细胞在冰上放置30分钟培养，清洗。

再用合适的第二抗体进行染色。

放置冰上30分钟后清洗；最后用链霉亲和素与聚乙烯共轭标记染色30分钟[17]。

作为阴性对照，细胞也可用相同类型免疫球蛋白替代先前的抗体进行染色，同上文所述第二抗体与链霉亲和素相同。

抗体有抗鼠CCR6,CCR9，CXCR3，CXCR6因子，小鼠IgG2a和IgG2b 阴性对照，(英国阿宾顿的安迪生物公司) ；生物素化的抗鼠免疫球蛋白和链霉亲和素与聚乙烯共轭物（来自英国牛津的BD Pharmingen公司）。

在跨内皮趋化因子实验中，间充质干细胞对每个趋化因子受体活性百分比由在FITC/FL1 通路中钙黄绿素标记细胞所决定，这种控制也用于在免疫球蛋白对照后平均荧光强度。

统计为了了解小鼠间充质干细胞在在趋化因子存在下跨内皮迁移在机制，我们使用方差分析，方差分析用一系列合适数据对比，用Dunnett测评来作为对照。