世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版
人类神经系统的神经元元件模型
人类神经系统的神经元元件模型人类神经系统是一个复杂而神奇的系统，它由数百万个神经元和支持细胞组成，这些细胞通过神经递质传递信息以控制身体各个部分的行为和功能。
神经元是人类神经系统的主要元件，它们与其他神经元和细胞以特殊方式相互作用，从而形成我们日常生活中感性和认知的精细和动态表现。
在本文中，我们将介绍神经元的基本结构和功能，并讨论一些神经元元件模型，以帮助我们更好地理解神经元之间的信息传递过程。
一. 神经元的基本结构神经元包括一个细胞体和多个突起，它们与其他神经元、肌肉和腺体相连接。
细胞体包括核、细胞质和线粒体，它主要负责细胞的代谢功能。
神经元的突起包括轴突和树突，它们具有不同的结构和功能。
神经元通过突起之间的相互作用传递信息。
轴突是神经元的主要输出突起，它负责将神经脉冲从细胞体传递到与之相连的神经元、肌肉或腺体。
轴突之外包裹着一个细胞膜，形成了一个电阻较大的隔离层，防止神经脉冲在轴突外泄。
为了提高神经脉冲在轴突中的传递速度，轴突通常被髓鞘包覆。
髓鞘是由多层脂质和蛋白质构成的，它提高了跨越轴突的神经脉冲传递速度。
树突是神经元的主要输入突起，它们负责接收来自其他神经元的信息，并将该信息传递到细胞体和轴突。
树突上有多个叶状突起，它们扩展到神经元周围的所有区域，形成了一个广泛的输入区域。
二. 神经元的功能特点神经元通过神经脉冲传递信息，这是一种电化学传递过程。
在神经元兴奋时，其细胞膜内外电势差逐渐增加，直到达到阈值。
如果阈值被触发，则神经元会产生一次动作电位，即神经脉冲。
神经脉冲会沿着轴突传递并到达与之相连的神经元、肌肉或腺体。
神经元输出的神经脉冲可以被其它神经元接收和处理。
神经元之间的相互作用形成了神经网络，它们可以处理和储存信息，并对外界刺激做出反应。
与此同时，神经元还能够在内部调节其活动，以适应外部环境变化。
神经元的功能特点与其结构密切相关。
例如，神经元的轴突直径和髓鞘厚度决定了神经脉冲的传递速度。
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
神经元原代培养
神经元原代培养Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。
选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。
对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。
将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。
灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。
2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O:0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红： 0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。
3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200μl或400μl/tube分装, -20度储存。
母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。
配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。
用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。
4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50μl/tube，-20℃保存。
使用时需将终浓度调整为25μM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。
配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。
例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。
5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。
6）阿糖胞苷（AraC）母液： 10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。
神经元原代培养实验报告
一、实验背景神经元是神经系统中最基本的结构和功能单位，研究神经元生物学特性对于理解神经系统疾病和开发新的治疗方法具有重要意义。
神经元原代培养是研究神经元生物学特性的重要方法之一，它能够模拟体内神经元的生长和发育过程，为神经元生物学研究提供了一种有效的手段。
二、实验目的1. 掌握神经元原代培养的方法和步骤。
2. 观察神经元原代培养过程中的形态学变化。
3. 分析神经元原代培养过程中细胞生长、增殖和分化情况。
三、实验材料1. 实验动物：E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠。
2. 试剂：含10%胎牛血清的DMEM培养基、神经元维持培养基(NeurobasalB27谷氨酰胺）、胰蛋白酶、抗神经丝抗体、荧光染料等。
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 取E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
2. 将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态学变化。
4. 培养第3天，进行细胞计数，观察细胞生长速率。
5. 培养第5天，进行免疫荧光染色，观察神经元纯度。
6. 培养第10天，进行神经元分化实验，观察神经元功能。
五、实验结果1. 细胞形态学观察：神经元原代培养过程中，细胞从圆形逐渐转变为梭形，并逐渐出现突起，形态逐渐成熟。
2. 细胞生长速率：培养第3天，细胞生长速率为（2-4）×10^4个/皿；培养第5天，细胞生长速率为（4-8）×10^4个/皿。
3. 神经元纯度：免疫荧光染色结果显示，神经元纯度达到90%以上。
4. 神经元分化实验：神经元分化实验结果显示，神经元在培养过程中逐渐分化为不同类型的神经元，如运动神经元、感觉神经元等。
六、实验讨论1. 神经元原代培养过程中，细胞形态学变化与体内神经元生长和发育过程相似，为研究神经元生物学特性提供了有力手段。
2. 细胞生长速率受多种因素影响，如培养基、温度、CO2浓度等。
神经元原代培养 丁香园
（丁香园protocol 2008）一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。
神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O 和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。
二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被10 min，吸除，无菌操作台上15min 自然晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化20 min 左右，期间轻摇数次；过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1100 rpm离心5 min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；12小时内禁止晃动6、换液：接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3 d半量换液。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
大鼠神经元细胞的原代培养
实验五：大鼠神经元细胞的原代培养2010级硕士研究生，周二组，严森，122010000178原代培养的细胞会不可避免地存留少量异质细胞一同生长．为了后续实验结果的针对性和准确性，一般都需要对培养物进行纯化。
纯化神经元的方法有很多种，最简便及常用的是采用有丝分裂抑制剂阿糖胞苷来抑制异质细胞的存活和生长。
神经元的分化增殖完成于胚胎期，大部分神经元在出生后即为永久的分裂后细胞，但其他细胞则仍然不断地进行分裂增殖，使用有丝分裂抑制剂后，非神经元的细胞生长会受到抑制及淘汰，神经元由此得到纯化实验材料：Hanks液，DMEM培养基10ml，有刻度吸管两只，弯头吸管两只，无刻度吸管一只，新生乳鼠（24小时）0.05%胰酶，1%双抗，10%胎牛血清，培养皿，小烧杯，空的离心管，镊子，剪刀，酒精灯，酒精棉，实验前准备工作：肥皂洗手，新吉尔灭擦手，开通风柜，将吸管从套筒中取出放入各自对应的试管内，将橡皮塞安装到各自吸管上，酒精灯分别迅速灼烧，1配液Hanks液近40ml加1%双抗1ml，加完双抗的小吸管留作计数，在DMEM培养基中加10%胎牛血清（已配好，全部加入），从离心管取一滴碳酸氢钠调节pH值至溶液呈紫色，一离心管0.05%胰酶，2.取材。
乳鼠新生24小时。
3，洗涤剪碎，在培养皿中加入少许Hanks液洗涤，将乳鼠头部用酒精棉擦拭消毒，在乳鼠头部位置剪一个工字型切口，将皮肤颅骨沿着切口依次剪开剥离，取出大脑组织，并去除乳鼠的血管脑膜，用弯头吸管将Hanks液与剥离干净的脑组织移走到另一个干净的培养皿中，用弯头吸管洗走洗液，弯头吸管将含有脑组织的Hanks移入到小烧杯中剪碎，每个组织块近似一立方毫米，静置后洗走上面的Hanks液，（吸取Hanks液时勿将下面的组织块洗走），同样方法再用Hanks液洗涤一次4．酶解，加一离心管0.05%胰酶，将上述小烧杯中的组织液移入空置的离心管中，37摄氏度水浴10分钟，观察组织块是否变小，静置2分钟，使组织沉淀下来，弃掉上请胰酶后，加DMEM培养基（全部倒入）来中和胰酶，吹散组织液5.离心1200转每分钟，离心5分钟，弃掉上清液，沉淀后加Hanks液吹散重悬组织液，用同样的转速和时间在离心一次，加完全培养基3-4mL吹散，静置1分钟，以便消化大块组织6.计数，取0.1ml离心后的细胞液加入苔盘蓝染色，加样抢加0.1微升与计数板计数，同时剩余细胞液加入培养瓶中进行培养接种，标注好组别和时间，培养细胞的名称37摄氏度，二氧化碳培养箱中，下周实验课观察细胞培养情况。
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世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。
培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。
其中，neurobasal 是胎鼠培养基，而-A为新生鼠培养基。
不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。
很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。
由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。
注意！由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27（也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金），血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。
所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。
另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。
大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.3.解剖过程一定要全程在冰上预冷。
这就意味着，从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。
另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。
一定要注意多准备冰袋子。
确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行（消化步骤除外）。
这样可以大大提高存活率。
在解剖大脑时候，有人用hank's，在其中解剖。
根据我的经验，即使是0度，神经元还是在进行着很大程度代谢。
所以，hanks的无糖环境很不利。
我个人建议，用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。
这其中还有一个问题，就是DMEM培养液会在空气中变碱性。
国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为L-15不会再空气中变碱性。
没有L-15的(国内几乎没有），可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。
注意注意：一切操作都在冰浴的液体中，所以要多准备冰袋。
（中途冰袋没了的是猪头）4.关于培养皿的问题。
一般来说，6孔板是最佳选择。
神经元让人苦恼的问题是，神经元发育的情况和密度相关。
大于6孔板（比如6CM DISH）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。
而太小的话（96孔或128孔）细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。
所以笔者经验是6孔板是最佳选择。
神经原代培养一定是要包被，用POLY-LYS或者胶原。
关于POLY-LYS包被，我们是包被30分钟，吸干晾过夜，然后洗两次，或者只洗一次但是要30分钟接着晾干。
由于neurobasal培养法相当成熟，所以没必要用难固定的胶原。
5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候，一定要注意母鼠状态，是否有死胎，胎儿胎盘是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的（一般是E16-E18）这些信息也要严格记录。
处死孕鼠后，要立即取出子宫放入冰冷培养液中。
注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒，防止污染。
一般来说，冰袋笔者选择一面蓝一面白的。
蓝的朝上，可以很清晰看到海马结构。
而去除血管膜的时候，白的那面朝上，这样可以很清楚看到血管膜。
从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做，我就不多说了。
不过有一点要注意，不管你是用皮层还是海马，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中。
我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中。
就是说，处死后要迅速把大脑的温度降到0.6：最影响原代培养的成败因素之一：这小段请大家一定注意看。
无论皮层还是海马，上面都是有一层血管膜。
注意：一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。
可以用解剖显微镜。
胎鼠很好剥离，而新生鼠则比较难。
这里千万不能粗心大意！！血管膜没剥离干净的后果是：1 吹打时候很难吹打下来神经元，被迫多次吹打，造成神经元大量死亡；2 血管膜一部分细胞会混入原代培养中，这些细胞往往会分裂，导致你的培养成果根本不能用。
可以说，剥离的不好不干净，实验就是失败的，不可能得到高质量的神经元。
注意的事情二：如果是要的是皮层的神经元原代培养，而皮层的细胞很多，切忌不要放太多皮层消化吹打！过多的细胞反而会导致神经元大量死亡。
另外，请仔细注意文献中要的是皮层哪一部位。
没有详细要求的话一般是取顶端。
从大脑到单个海马的剥离我不细说了。
我现在以海马神经元为例。
在所有海马都成功剥离后，请仔细的去除血管膜，原因上面说过。
最后，请再仔细检查一下是不是都去掉了。
确认后，海马片段被移入一个小烧杯里，加少量培养液，用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小块，放置冰上准备消化，7：实验成败的关键之二：消化。
一般来说，我看很多人都用0.125%的胰酶消化。
实话说，胰酶消化非常的难以掌握速度，而且消化效果真的是--很烂！稍微不注意，就会消化过头，细胞都消化光了。
而胰酶消化的快，还会出现细胞快速破裂释放出DNA，和其他蛋白缠结成絮状包裹在组织块外面，使得块里面的不到应有的消化。
所以我个人不推荐胰酶。
想做一个完美成功的消化，我强烈推荐木瓜酶+DNA酶。
木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶（见附图）。
笔者是配成2mg/ml的木瓜酶。
另外要用的是DNA酶。
DNA酶的作用是，消化掉破裂细胞的DNA，避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。
DNA酶由于各个公司的活性不一样，很难有标准浓度，需要摸条件，不过不是很严格，只要能防止DNA缠结就好。
木瓜酶的特点是不会消化过头，非常温和。
缺点是一定要现配（请直接用无血清的培养液配来保证神经元的营养代谢，而且一定要现用现配。
消化的技巧：消化时候，很多人有不良习惯，喜欢用个50ml试管装着所有东西。
结果是组织都沉底，下面消化不足，上面消化的没细胞。
笔者的技巧是，用一个6或10CM 培养皿来消化。
这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层，均匀分布着组织块，从而彻底解决了上述问题。
消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+适量DNA酶。
木瓜蛋白酶很便宜请放心。
消化过程是20-30分钟。
由于木瓜蛋白酶温和，因此不会消化过头，使得你的实验消化的很稳定。
消化时候请在37度温箱里，每5分钟稍微摇动一下。
注意：1）木瓜酶不要用巯基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率坏很多；2）尽量用不含血清的培养液来配置木瓜酶而不是用hanks，使得神经元保持营养；3）木瓜酶一定要现用现配。
再次重申：除了消化过程中要37度，其余任何时刻都是要浸泡在0度（冰浴）的液体中。
消化过后可以用1ml血清终止反应（我是用马血清，便宜，但是切忌不要用国产血清，污染几率很大）。
把消化用的培养皿放在冰上冷却，然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打。
整个体系静止2-3分钟，然后仔细的去掉上层的液体，保留消化过的组织块8.实验成败最关键最关键的：吹打。
笔者经验是，没有必要用巴斯德管。
对于胎鼠和10天之内的新生鼠，一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果。
在一边被垫高的皿里面，加入1-1.5ml新鲜培养基和少量DNA酶，吹打10次。
吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。
吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。
轻柔吹打是细胞成活关键！要用进口枪头，国产的有时候会过细。
我们采用的是最合理的分步吹打法。
每个10次吹打过后，静止2分钟。
这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面去。
上面的那层就是你要的单个悬浮细胞，把它们挪到指定容器里（一样要冷在冰上）。
下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃，再加1-1.5ml新鲜培养液，重复刚才的步骤，轻柔吹打，再静止2分钟，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打3次。
3次之后如果还有团块在下面，请果断丢弃。
造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。
这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打，而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。
重申一下，为了保证最大程度收获活细胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。
这招可以更容易收获大量高质量细胞，尤其是实验材料不足时候。
消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，这样反而会使大量细胞死亡。
实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话，切忌不要放入过多皮层。
9（可选可不选，但是我建议全选）神经元进一步纯化。
一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。
但是，由于实验者等个人或者客观原因，血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，造成死细胞过多，影响种板等等原因，还是会影响到培养的神经元的质量。
为了克服这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心。
现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候，NycoPrep™ 1.077 推荐稀释成60%，就用刚才悬浮细胞的培养液来配置。