原代海马神经元细胞培养
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定【关键词】胎鼠海马神经元；体外原代培养；鉴定doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.568 文章编号：1004-7484（2013）-06-3323-02在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。
海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。
对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。
我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。
1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天sd大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：scxk（沪）2012-0002。
1.2 主要仪器与试剂 co2培养箱（thermo公司），倒置相差显微镜为（olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为zeiss lsm710，小鼠抗大鼠classⅲβ-tubulin单抗（beyotime公司），nse免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），b27添加剂、neuralbasal、hoechst 33342sigma公司），dmem（高糖型）培养基、胎牛血清（gibco公司）。
1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含dmem 的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm 大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%co2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%fbs的dmem液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
神经元细胞培养步骤
海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。
(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。
4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。
2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。
3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。
4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。
30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。
5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。
过滤液DMEM，进入大离心管中。
离心800r，3min。
弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。
6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。
7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定
胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。
海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。
海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。
1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。
1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。
海马细胞培养与鉴定
非特异性对照:用正常羊血清代替兔抗特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体,其它实验步骤上。
阴性对照:用PBS代替兔抗特异性烯醇化酶( NSE )多克隆抗体,其它实验步骤同上。
纯度计算：高倍镜视野下，随机选取计数视野，计数100个细胞中阳性神经元的数目，重复5次后，计算均值。
吸去培养液用PBS液冲洗3遍
↓
质量分数为4%的多聚甲醛固定15 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
质量分数为0.4%的Triton X-100湿盒反应40 m in;
↓
0.01mol/LPBS液中洗15 m in;（5min×3次）
↓
3%H2O2孵育15min,消除内源性的过氧化物酶
搅拌。
↓
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
↓
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
↓
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
↓
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
↓
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。另一方面，请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。
b.在免疫组化时如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。
c.可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。
步骤：
大鼠海马神经元原代培养
汇报人：何克宇
S
实验要点
S 取活体细胞
S 令海马神经元贴壁生长
S 神经元培养液
实验材料
S 动物：大鼠胎鼠（15~20天）
S 试剂：多聚赖氨酸
解剖液（DMEM+PBS） 0.125%胰蛋白酶
S 培养液：①DMEM+F12+10%胎牛血清
②Neurobasal+2%b27+1%双抗
1. 胰蛋白酶（预暖）消化15min，3~5min震荡一次。
2. 静置2min，去上清，PBS洗两遍终止消化 3. 加入DMEM，吹打，取上清。重复3次。 4. 种板，培养液（DMEM+F12+10%胎牛血清），细
胞密度3.5*105/cm2
抗）
Thank You
实验步骤
1.器械灭菌 2.多聚赖氨酸（PLL）铺板
0.1mg/ml，包被30min，吸去多余PLL，
过夜晾干
实验步骤
1.孕鼠颈椎脱臼处死，取胎鼠 2.胎鼠断头，置于PBS，取全脑，置于解剖液（冷） 3.体视显微镜下沿中线分离半球，取海马，仔细分离血 管和膜性组织。（快、干净）
实验步骤
实验步骤
大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定
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ｔ ｅＮ Ｙ ｅ ，Ｓ ｉ—ｉ ｇ ，Ｚ Ｎ ｏｇ ，ＺＨＡＮＧ ｎ —ｈｅ Ｅ ｕ Ｕ Ｑｕｘａ ＨＡ Ｇ Ｙ ｎ ｎ
（ ． Ａ ａｅ ｃＡｆ ｒ Ｄ ｓ ｎ ｈｎ ａｇＭｅ ｉ ｌ ｏｌ ｅ Ｓ ｅ ｙ ｎ １ ０ ４ ｈｎ ；２ ｅ ａｔ ｅ ｔ ｆＨ ｓ ｌ ｙａ ｄＥ ｒ ｌ ｙ １ ｃｄｍｉ ｆｉ Ｍ ｉ ，Ｓ ｅｙｎ ｄｃ ｌｇ ， ｈ ｎ ａ ｇ１ ０ ３ ，Ｃ ｉａ ．Ｄ ｐ ｒ ｎ ｉ ｏｏ ｎ ｍｂｙ ｏ ） ａｓ ｏ ａＣ ｅ ｍ ｏ ｔ ｇ ｏｇ
（ ．沈 阳医 学 院 教 务 处 ，辽 宁 沈 阳 １０ ３ １ １０ ４；２ 基 础 医学 院组 织 与 胚 胎 学 教 研 室 ） ．
［ 摘要 ］目的 ：为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有 效的鉴定其 纯度 。方法 ：分 离 Ｗｉａ大鼠胚胎 并 ｓ ｔ 取海马组织 ，比较 两种 常用酶 ，胰 酶和木瓜 酶消化效果对海马神经元产量的影响及 两种不 同培养方法对海马神 经元纯度 的
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
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原代海马神经元细胞培养
溶液的配制：
(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，
室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol⋅l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4⋅12H2O，1.7g；KCl，
0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液
冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸
放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04⋅7H20，0.18g；
KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg⋅ml-1的母液储存。
用0.2μm滤膜过滤，-20℃
储存。
使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg⋅ml-1。
（根据实验情况调整浓度）
大鼠原代海马神经元细胞的培养
(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解
剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全
部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
(3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎
片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。
(4) 在离心管中加入2ml的种植液，用口径递减的吹打管轻轻吹打海马碎片数次，将上
清液吸出备用，再加入2ml的种植液后，用吸管吹打数次，将上清液吸出备用，如此反复数次，至海马碎片全部被吹打散开。
（每次吹打10次，吹打时注意不要吹入空气，吹打尽量轻柔）
(5) 吸出的上清液再加入种植液调整其浓度，用200目细胞筛过滤。
(6) 将上述滤过的液体混匀后分装入已涂有0.1mg⋅ml-1多聚赖氨酸的96孔板上，使分
散的细胞计数约为0.3x106⋅ml-1。
然后将96孔板放入9%CO2，37℃细胞培养箱中培养。
(7) 12h后观察细胞，镜下可见多数细胞贴壁生长。
生理盐水冲洗细胞2遍以上以去除
细胞碎片然后换上已平衡好的饲养液。
(8) 培养36h后加入阿糖胞苷3μg⋅ml-1以抑制胶质细胞的分裂生长。
(9) 加入阿糖胞苷后12h换液。
以后每3d半量换液，饲养至7～14d可以进行实验。
(10) 或种板40min后，更换饲养液。
种板后12h，更换饲养液。
然后每3天半量换液。
注：第一种方法细胞纯度高，但对细胞损害较大，需要较高培养技术。
培养的细胞适用于MTT等实验。
第二种方法细胞纯度较高，对细胞损害较小，细胞状态好。
培养的细胞适用于膜片钳。