一种大鼠海马神经元的原代培养方法

南昌大学学报（医学版）２０１０年第５ｏ卷第３期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０１０，Ｖｏｌ一５０　Ｎｏ．３　种大鼠海马神经元的原代培养方法　周　明　，聂　菁　，吕　诚　，胡小令　（南昌大学医学院ａ．教务办；ｂ．解剖学教研室，南昌３３０００６）　

摘要：目的建立一种简便高效的海马神经元的原代培养方法。方法无菌环境下取新生ＳＤ大鼠（２４　ｈ内）海　马，清洗、剪碎，以０．２５　胰蛋白酶消化，２００目滤网过滤，混合培养，约５　ｄ后加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的生　长。采用免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）的表达情况，观察海马神经元形态。结果　海马神　经元纯度≥９０　。神经元接种３　ｄ后具有典型的形态特征，１３～１４　ｄ突起形成密集的神经纤维网络，１４　ｄ后细胞出　现凋亡。结论本实验方法步骤简便，可获得纯度较高的海马神经元，为研究与海马神经元相关的疾病提供了实　验基础。　关键词：海马神经元；细胞培养；鉴定；动物，实验；大鼠　中图分类号：Ｒ一３３２　文献标志码：Ａ　文章编号：１０００－－２２９４（２０１０）０３－－０００１－－０３　

Ａ　Ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　Ｎｅｕｒｏｎｓ　ｏｆ　Ｒａｔｓ　ＺＨＯＵ　Ｍｉｎｇ　，ＮＩＥ　Ｊｉｎｇ　，ＬＶ　Ｃｈｅｎｇ　，ＨＵ　Ｘｉａｏ－ｌｉｎｇ　（ａ．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ａｆｆａｉｒｓ　Ｏｆｆｉｃｅ；ｂ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎａｔｏｍｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｎａｎｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０００６，Ｃｈｉｎａ）　

ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｗｅｒｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ＳＤ　ｒａｔ（ｄｕｒｉｎｇ　２４　ｈ）ｕｎｄｅｒ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｒｉｎｓｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｔ　ｔｏ　ｓｈｉｖｅｒ，ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　０．２５　９／６　ｔｒｙｐｓｉｎ，ｆｉｌｔｅｒｅｄ　ｗｉｔｈ　２００　Ｓｉｅｖｅ，ｍｉｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｙｔｏｓｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏ—　ｓｉｄｅ（Ａｒａ—ｃ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｆｏｒ　５　ｄａｙｓ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｌ—　ｔｙ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＮＳＥ　ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａ１　ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　９０　９，６　ｏｆ　Ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ．Ａ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｐ—　ｐｅａｒｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｆｏｒ　３　ｄａｙｓ，ｕｐ　ｔｏ　１３ｔｈ　ｏｒ　１４ｔｈ　ｄａｙ，ｍａｎｙ　ｎｅｕｒｉｔｉｓ　ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ　ｎｅｔｗｏｒｋ。ａｔ　ｌａｓｔ，ｃｅｌｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｖｅｒｅｄ　ｉｎ　１　４　ｄａｙｓ　ｌａｔｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉＳ　ａ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｔｙ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ；ｃｅｌｌ　ｃｕｔｌｕｒｅ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ａｎｉｍａｌｓ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ｒａｔｓ　

海马属于大脑的边缘系统，是比较古老的皮质　结构，在学习、近期记忆、情绪及内脏功能调节等方　面起重要作用　］。大脑海马部位的神经元高度集　中，对多种致病因素较为敏感，是癫瘸、阿尔茨海默　病等神经系统疾病容易累及的部位之一。成功进行　海马神经元的体外原代培养能为探讨神经系统疾病　的发病机制以及筛选神经保护性药物提供良好的实　验平台［２］。本实验拟建立一种大鼠海马神经元的原　

收稿日期　基金项目　作者简介　通信作者　代培养技术，为以后的相关研究提供较高纯度的海　马神经元。　１材料和方法　１．１　实验动物　新生ＳＤ大鼠１Ｏ只（出生２４　ｈ以内），雌雄不　限，购自江西中医学院实验动物中心（动物合格证　号：ＪＺＤＷＮＯ．２００９—０１３７）。　２Ｏ１Ｏ—Ｏ１—２１　国家自然科学基金（３０６６００７３）　周明（１９８１一），男，硕士研究生，主要从事老年性疾病的基础研究。　吕诚，教授，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｖｃｈｅｎｇｌ１１８＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ。　２　南昌大学学报（医学版）２０１０年３月，第５０卷第３期　１．２主要试剂　ＤＭＥＭ／Ｆ１２高糖培养基和特优级小牛血清　（美国Ｇｉｂｃｏ公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程　材料有限公司），多聚Ｉ　一赖氨酸、胰蛋白酶（美国　Ｓｉｇｍａ公司），神经生长因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，　ＮＧＦ）（英国Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ公司），阿糖胞苷（北京索莱　宝科技有限公司），兔抗神经元特异性烯醇化酶　（ｎｅｕｒｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｌａｓｅ，ＮＳＥ）多克隆抗体（武汉博　士德公司），ＳＰ免疫组化试剂盒、ＤＡＢ显色试剂盒　（北京中杉金桥生物技术有限公司）。　１．３主要溶液配制　①解剖液（０．０１　ｔｏｏｌ·Ｌ　ＰＢＳ）：Ｎａ２　ＨＰＯ４　０．６　ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４　１．５５　ｇ，ＮａＣＩ　８．７７　ｇ，加蒸馏水至　１　０００　ｍＬ，ｐＨ值调至７．４，高温高压灭菌后，４℃保　存备用。②接种液（１００　ｍＬ为例）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２高　糖培养基８０　ｍＬ，小牛血清１０　ｍＬ，胎牛血清　１０　ｍＩ　，１００　Ｕ·ｍＩ　青霉素和１００　Ｕ·ｍＬ　链霉　素。③培养液（１００　ｍＬ为例）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２高糖培　养基８Ｏ　ｍＬ，小牛血清１０　ｍＩ　，胎牛血清１０　ｍＩ　，加　入１　ｇ·ｍＩ　ＮＧＦ使其终浓度为１Ｏ　ｇ·Ｌ一　，　１００　Ｕ·ｍｌ　青霉素和１００　Ｕ·ｍＩ　链霉素。　１．４仪器　ＣＯ　恒温细胞培养箱，倒置显微镜及照相系统　（Ｅｌ本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）。　１．５培养板的处理　将清洗干净的小爬片放人新的六孔培养板中，　每孔１～２片，每空加入１０％多聚赖氨酸１～２　ｍＬ，　包被３０　ｍｉｎ，三蒸水清洗，紫外线照射消毒，备用。　１．６海马神经元的分离、纯化和培养　新生ＳＤ大鼠用碘伏浸泡处死，无菌环境下冰　上开颅取脑，钝性分离出海马组织，将其放人玻璃皿　中用冰镇的解剖液反复冲洗，同时用镊子等器械将　脑膜和血管仔细剔除，之后用小直剪将脑组织充分　剪碎．力口入３～５　ｍＬ的０．２５％胰蛋白酶３７℃消化　５～１０　ｍｉｎ，待消化液浑浊即加入血清终止消化，吸　管充分吹打后，２００目铜滤网过滤；收集过滤后的细　胞液离心（１　０００　ｒ·ｒａｉｎ～，１０　ｒａｉｎ），弃上清液，加入　接种液，吹打制成细胞悬液；血球计数板计数，并以　１×１Ｏ　·Ｌ　的细胞密度接种入一次性六孔培养　板，３７℃，５　ＣＯ　恒温培养箱培养，２４　ｈ后换培养　液。３～４　ｄ后加入１　ｇ·　Ｌ　阿糖胞苷，使其终浓　度达到４　ｇ·ｍＬ＿。，以抑制胶质细胞的生长，４８　ｈ　后换液清除阿糖胞苷。以后根据细胞代谢情况，每　３至４天换液１次（１／２换液），同时在倒置显微镜下　

观察细胞形态和生长情况。　１．７海马神经元的鉴定　待海马神经元发育成熟后（约１４　ｄ后），取出爬　片，选择ＮＳＥ作为海马神经元的标志物，按标准的　免疫细胞化学染色ＳＰ法进行鉴定。方法如下：①　取出的爬片用０．０１　ＰＢＳ清洗２次，４　多聚甲醛　固定４０　ｒａｉｎ，ＰＢＳ浸洗５　ｒａｉｎ；②３　９／６　Ｈ２Ｏ２孵育　１０　ｒａｉｎ以消除内源性过氧化物酶活性；③滴加试剂　Ａ进行封闭，室温约１５　ｒａｉｎ，吸去，勿洗；④加入Ｉ　抗（ＮＳＥ，１：５０），４。Ｃ过夜，ＰＢＳ冲洗３　ｒａｉｎ×３次；　⑤滴加Ⅱ抗，室温１５～２０　ｒａｉｎ，ＰＢＳ冲洗３　ｒａｉｎ，３　次；⑥滴加试剂Ｃ，室温１５　ｒａｉｎ，ＰＢＳ冲洗３　ｒａｉｎ×３　次；⑦ＤＡＢ显色试剂盒显色３～５　ｒａｉｎ，ＰＢＳ冲洗　３　ｒａｉｎＸ　３次。最后经酒精脱水、二甲苯透明、中性树　胶封片，镜下观察，摄片。以ＰＢＳ（０．０１　ｔｏｏｌ·Ｌ　）缓　冲液代替Ｉ抗作阴性对照。　神经元纯度计算方法：在高倍显微镜下随机选　取５个视野，计算出其中阳性细胞的个数，换算成百　分比，重复５次，取其均值作为阳性神经元的纯度。　

２　结果　２．１　海马神经元培养过程中的细胞形态　倒置显微镜下，细胞种植培养２４　ｈ后可见大部　分细胞已贴壁，但培养液内杂质较多，换液去除杂　质；３　ｄ后可见部分细胞具有神经元的形态特征，胞　体多呈圆形、锥型，发出一些短突起，少部分突起较　长，但背景可见大量阿米巴样的神经胶质细胞（图　１）ｎ　５　ｄ左右加入阿糖胞苷处理后，非神经元细胞　大量死亡，神经元凸显于视野，胞体增大、突起延伸　（图２）。培养１３～１４　ｄ经免疫细胞化学染色可见，　神经元胞体饱满，核大，突起明显增长，连接密集，形　成复杂的神经纤维网络（图３）。１４　ｄ后神经元活力　下降，部分细胞开始裂解、凋亡。　

图１培养第３天的海马神经元