成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2）（1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆明650031）［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞．［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in AdultRat sLI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2）（1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China）［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies.［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.第32卷昆明医学院学报30海马神经细胞培养逐渐广泛应用在神经细胞和发育生物学研究中．建立海马神经细胞培养模型可为研究海马相关老年性疾病提供实验技术支持．而目前的研究中，大多报道的是新生大鼠或者胎鼠海马神经元培养方法[1-3]．成年海马神经元培养因难度较大，报道不多．而在海马相关性疾病中，海马的变化大多发生在成年或者老年[4-6]．因此，用成年海马神经细胞来研究海马衰老相关疾病有更为重要的科学价值．本实验获取成年小鼠海马，制备细胞悬液，接种于培养板，观察成年海马神经细胞体外生长特性，为研究衰老相关疾病提供体外细胞模型．1实验方法1.1所需设备及仪器（1）实验仪器：超净工作台、培养箱、解剖显微镜、倒置显微镜、离心机；（2）实验器械：显微镊、扁平尖镊、大剪刀、小剪刀、血管钳、弯镊.（3）培养用具：培养皿、数根长玻璃吸管、离心管、橡胶吸头、1mL、200μL、20μL枪头、培养板.（4）培养试剂：消毒三蒸水、D-Hanks 液、多聚赖氨酸、层粘连蛋白、小牛血清、马血清、M EM培养基、谷氨酰氨、碳酸氢钠、葡萄糖．（5）实验动物：年龄在1岁左右的小鼠．1.2溶液的制备（1）多聚赖氨酸-层粘连蛋白的制备：将多聚赖氨酸用无菌三蒸水配成0.01%的溶液，用无菌MS液配成0.01%的层粘连蛋白，然后按50mL 0.01%的多聚赖氨酸加2mL0.01%的层粘连蛋白溶液．将此液包被24孔培养板于每孔加入200μL，置37℃的温箱内4h或室温下过夜后吸出多余液体，再用无菌三蒸水充分漂洗4～5遍，待干备用；（2）阿糖胞苷的制备：称取0.01g的阿糖胞苷加三蒸水至25mL，过滤在-20℃储存（1.4 mM stock），再取 1.4mM stock加MS溶液（v/v=1/3）配制浓度为100μg/mL的溶液，使用时工作浓度为2.5μg/mL，即24孔培养板中，每孔400μL的培养液浓度为100μg/mL的阿糖胞苷10μL．6孔培养板中每孔3mL培养液加75μL；（3）葡萄糖-碳酸氢钠储存液（GB stock）的制备：称取碳酸氢钠26.66g、葡萄糖44.44g加三蒸水至1L．过滤除菌后分装置4℃冰箱储存；（4）培养基储存液（Media stock）的制备：在无菌条件下取已过滤10x MEM100mL，GB stock90 mL，加无菌三蒸水900mL混匀后，分装置4℃冰箱储存，若近期不用则置-20℃储存；（5）D-Hanks液的制备：称取KCL0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCL18.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4·7H2O0.09g，酚红0.01g，加三蒸水溶解至1L，过滤除菌后分装置4℃冰箱储存.（6）神经元培养基的制备：量取FBS50mL、HS50mL、0.142%的谷氨酰胺10mL，加培养基储存液（M S）至总量为1L，分装置4℃冰箱储存，若近期不用则置-20℃储存．1.3海马组织的分离，细胞悬液的制备与接种成年小鼠采用颈椎脱桕处死后，放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒1～2min．剪开头部皮肤向两侧拉开，暴露整个颅骨，用小剪刀打开颅骨，完整取下全脑，置于无菌的D-Hanks液培养皿中．洗净脑表面血液，移入另一盛有D－Hanks液的培养皿中．沿背侧表面正中矢状位，用镊子向外侧小心掀开大脑皮质，即可在正中矢状位见“C”字型海马；用镊子夹住海马，向周边组织分离，即可获得整个海马；解剖显微镜下剥离覆盖在海马表面的其它组织及脉络从，将海马剪成碎组织块，用玻璃管吸入安瓶中，待组织块下沉吸去上层的D-Hanks液，加入培养液吹打40～60次，制成细胞悬液后用网筛过滤．取少量细胞悬液加等量胎盼兰混匀，加在计数板上，在100倍倒置显微镜下计数细胞密度，以2×105个细胞/mL，接种于24孔培养板，置37℃5%CO2培养箱培养．1.4形态学观察分别于培养后1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，描记胞体和突起形态变化．1.5免疫组织化学染色鉴定用神经元特异烯醇化酶抗体染色鉴定神经元．取培养细胞按如下程序进行免疫组化染色: 0.05M PBS漂洗5min×3次，3%H2O2室温处理切片30min；5%羊血清（0.3%Triton×100，0.01 M PBS配制）37℃封闭背景30min；用含兔抗神经元特异烯醇化酶多克隆抗体（Santa Cruz，工作浓度1:500）的PBS缓冲液（含0.3%Triton×100，3%羊血清）4℃孵育48h；PBS洗5min×3次；生物素化二抗（1:200，0.05M PBS配）孵李玉，等．成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定31第6期育37℃1.5h ；PBS 洗5min ×3次；AB 复合物（1:100，0.05M PBS 配制）37℃孵育1.5h ．PBS 洗5min ×3次；0.05M Tris ．HCl 37℃孵育15min ；0.05%DAB （0.05M Tris ．HCl 配制，含0.03%H 2O 2，pH7.5）显色5min ；PBS 终止反应．裱片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片．在光学显微镜下观察神经元免疫阳性反应情况及其亚细胞定位．2结果2.1细胞形态学培养1～3d ，可见较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少，圆而透明（见图1A ，B ）．以后每隔3d 半量换液1次．虽杂质不断减少，但仍有杂质及一些死细胞覆盖在贴壁细胞上空至不易见生长细胞的情况．培养第7天换液后，细胞生长状况明显变好，细胞胞体丰满、胞浆透明、折光良好，部份似单极神经元，多数呈多极神经元形态，胞体一端或两端可见长出长短不一的突起，有的还呈生长锥形态（见图1C ）．培养第10天，细胞继续生长，突起长度有所增长，但不明显．能见到有的细胞突起相互间开始有接触；也能见一些多极神经细胞的突起分叉呈树枝状（见图1D ）．培养第13天时观察，可见许多多极神经元，这些神经细胞的胞体发出几个主干树突，伸向各个方向，并再发出二极和三极分支，细胞突起形成网络状（见图1E）．培养第15天，发现大部分神经细胞有退化早期征象，部分细胞胞体内出现明显的颗粒（见图1F ）．图1成年海马神经元培养Fig.1Cult ur ed hippocampus neur ons A:1d ；B:3d ；C:7d ；D:10d ；E:13d ；F :15d.AB CD EF2.2免疫组织化学染色结果神经元特异烯醇化酶抗体染色鉴定神经元结果显示，神经元胞体呈现棕色阳性染色，说明培养细胞是神经元（见图2）．3讨论文献报道，海马结构（Hippocampal formation ）由海马、齿状回和下托组成，属于古皮质．胚胎时期，海马结构位于大脑半球内侧面，相当于海马沟下方及脉络裂上方之间的区域．随着大脑颞叶的发育，上述二裂皆被卷入颞叶的前下方，于是海马结构即相当于从室间孔处延至侧脑室下角顶部之间的一个弓状皮质区[7]．本实验中，依据解剖位置，通过掀开皮质，笔者准确获取海马，从而保证了取材的可靠性．观察发现，海马前端较宽，表面覆有室管膜，膜的深面是一层白质，白质的纤维向后内方聚集，形成纵形的海马伞，向后续于穹窿脚．齿状回是一条狭长的皮质带，除内侧面外皆为海马所包绕．在内侧的游离面上有许多横沟，形如齿列，故此而得名．齿状回的内侧面位于海马沟和海马伞之间，海马伞的游离缘直接延续于其上方的脉络层，软膜和血管就沿膜络裂凸入侧脑室内形成膜络层，覆盖于海马表面．因此，获取海马后要将海马表面的被膜剥出干净，以减少成纤维细胞成分．按照细胞学特征和纤维联系一般将海马本部分为CA1、CA2、CA3、CA4四个区．CA1与下托（位于海马旁回皮质和海马之间的过度区域，相当于海马旁回的上部）相连，CA4与居海马与齿状回移行部．海马本部按细胞构筑学又分为五个亚层：多形细胞层、锥体细胞层、辐射层、腔隙层和分子层，但其主要细胞是锥体细胞．齿状回是海马的传入门户，主要有颗粒细胞．它接受内嗅区的传入，发出苔藓纤维到CA3区，其轴突又组成了海马的传出纤维与CA1区锥体细胞形成突触；CA1发出的纤维又回到内嗅区，这样就形成了一个连续的四级神经元还路[8，9]．可见，海马结构和细胞成分比较复杂，这与本实验观察到海马细胞的多形性一致．笔者观察到的细胞包括单图2海马神经元特异烯醇化染色（×400）Fig.2Neur al specific enolase labeled neur ons inhippocampus （×400）极神经元和多极神经元．值得注意的是，成年海马神经元培养，并不像想象的那样接种后就开始生长．其恰恰在第1周生长很缓慢，不易观察到细胞生长，但经过几次换液后效果明显变好，生长的细胞显示出来．在培养中要注意．此外，鉴于海马神经元在7～14d 生长良好，而15d 后有退变现象，故建议利用海马神经元进行体外研究选择10d 左右较好．本实验为了解成年小鼠海马神经元体外生长特性提供了重要的实验证据，有一些新发现，研究结果为海马神经元体外培养模型建立和应用提供了重要的实验依据．［参考文献］［1］TANAKA H ．Culturing hippocampal neurons ［J ］.Nipp-on Yakurigaku Zasshi ，2002，119（3）：163－166.［2］李劲涛，黄桂琴，王廷华，等．GFP 转基因胚胎小鼠海马神经元培养方法的建立［J ］．昆明医学院学报，2006，27（6）：23－26.［3］周明，聂箐，吕诚，等．一种大鼠海马神经元的原代培养方法［J ］．南昌大学学报（医学版），2010，50（3）：1－3.［4］DE BUNDEL D ，SCHALLIER A ，LOYENS E ，et al ．Lossof system xformula does not induce oxidative stress but decreases extracellular glutamate in hippocampus and influences spatial working memory and limbic seizure susceptibility ［J ］．J Neurosci ，2011，31（15）：5792－5803.［5］WEIS S ，LEUBE D ，ERB M ，et al ．Functional neuroana-tomy of sustained memory encoding performance in healthy aging and in alzheimer's disease ［J ］．Int J Neurosci ，2011，29（5）：115－117.［6］VANGUIDER H D ，FARLEY J A ，YAN H ，et al ．Hippo-campal dysregulation of synaptic plasticity －associated proteins with age-related cognitive decline ［J ］．Neurobiol Dis ，2011，43（1）：201－212.［7］陈玉敏．海马的解剖定位研究［J 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